Подсчет форменных элементов крови
Подсчет форменных элементов крови. Определение количества эритроцитов в 1 мм 3 крови производят в счетных камерах Тома, Горяева, Предтеченского и других. Кровь набирают в капилляр меланжера до деления 0,5 и разводят физиологическим раствором поваренной соли, который добирают до черты 101. Взвесь тщательно перемешивают в течение 2—3 мин. и, удалив содержимое самого капилляра, заряжают камеру. Для этого при подсчетах в камере Тома — цейсса небольшую каплю крови помещают на сетку, покрывают ее покровным стеклом и осторожно пришлифовывают его до появления ньютоновых колец. Зарядка камеры Тома требует большого опыта и педантичной техники. Наполнение камер системы Горяева значительно проще. Наложив покровное стекло, мякишами пальцев его притирают до появления ньютоновых колец и затем каплю взвеси эритроцитов помещают на выступающий из-под покровного стекла край центральной пластинки. Жидкость быстро распределяется между покровным стеклом и камерой, причем излишек ее стекает в боковые каналы.
Заряженную камеру помещают на столик микроскопа и, пользуясь малыми системами, находят сетку. Выждав затем 2—3 мин. пока взвесь эритроцитов осядет на дно, производят подсчет. Установив в поле зрения большой квадратик сетки, счет первого верхнего ряда малых квадратиков ведут в направлении слева направо, второй ряд подсчитывают справа налево и т. д. по кривой, меняя направление с каждым рядом. При этом в каждом квадратике подсчитывают не только клетки, расположенные внутри, но и прилегающие к верхней и левой ограничивающим его линиям, а также лежащие в левом верхнем и правом нижнем углах. Обычно ограничиваются подсчетом 4—5 больших квадратиков.
Вычисление производят по формуле Y = 400 К V, где Y — среднее количество эритроцитов в большом квадрате, V — степень разведения взвеси. При разведении 1 : 100, чтобы получить результаты подсчета, достаточно количество эритроцитов в большом квадрате помножить на 25 000.
Камеры и смесители следует содержать в чистоте, тщательно их очищая после каждого определения. В последнее время для подсчетов пользуются обычно оксалагной кровью. Как показывает опыт, эритроциты при температуре не свыше 7° оказываются довольно устойчивыми к щавелевокислому натрию; подсчеты консервированной оксалатом крови в течение трех дней после ее взятия показывают по сравнению с нативной кровью снижения около 5°, что большого практического значения не имеет.
Полицитемии обычно являются следствием сгущения крови.
Олигоцитемии, вследствие распада эритроцитов, наблюдают при многих лихорадочных и инфекционных заболеваниях, хронических болезнях, истощении и т. д. Резкие олигоцитемии особенно важны в диагностике инфекционной анемии, обычно связанной со значительным уменьшением их количества. Показательными для инфекционной анемии являются падения ниже 5 млн. При острых формах иногда наблюдают уменьшения до 4 млн. Падения ниже 2 млн. сравнительно редки. Известны случаи, когда при инфекционной анемии количество эритроцитов падало до 1 млн. и даже 500—250 тыс.
Подсчет лейкоцитов производят в тех же счетных камерах. Для разведения крови пользуются растворами, гемолизирующими эритроциты, напр. 2-проц. раствором уксусной кислоты, подкрашенным 1 мл насыщенного раствора метиленовой сини. Взвесь приготовляют в меланжере для лейкоцитов, набирая кровь до метки I и разводящий раствор до метки II. Зарядив обычным путем камеру, производят подсчет по всей сетке (в 400 квадратов).
В тех случаях, когда требуются более точные цифры, камеру заряжают три раза, производя расчеты из средней арифметической трех определений. Вычисление производят, умножая количество подсчитанных на всей сетке лейкоцитов на 100.
Подсчет тромбоцитов основан на определении их отношения к количеству эритроцитов. Для приготовления мазка пользуются 14-проц. раствором сернокислой магнезии, которая препятствует склеиванию пластинок. Каплю раствора наносят на поверхность хорошо очищенной кожи и укол производят так, чтобы кровь смешалась с раствором. Обычным путем приготовляют мазок крови, стараясь вытянуть его как можно тоньше. Хорошие препараты получаются после фиксации в спиртовом растворе сулемы (100 мл абсолютного спирта, 0,01 сулемы и 6 капель уксусной кислоты), с последующей окраской по Романовскому — Гимза.
В окрашенном тонком мазке подсчитывают все эритроциты и все тромбоциты. При этом обычно пользуются окошечком, делящим поле зрения микроскопа на 4 части. Подсчитав 3 тыс. эритроцитов, определяют, какое количество тромбоцитов падает на 1 тыс. эритроцитов. Путем простого пересчета нетрудно определить их абсолютное содержание в 1 мл. крови.
В крови лошади в среднем на 1 тыс. эритроцитов приходится 17 тромбоцитов, в 1 мм 3 их содержится 350 тыс. Увеличение тромбоцитов наблюдают при мыте, крупозной пневмонии, плеврите, гемоглобинемии. Уменьшение (тромбопения) характерно для morbus maculosus, инфекционной анемии и стахиботриотоксикоза.
Приготовление препаратов крови. Обычно мазки крови приготовляют на предметных стеклах, которые должны быть совершенно чисты и свободны от следов жира, кислот и щелочей. Для очистки хорошо вымытые и обезжиренные стекла промывают в проточной воде в течение 2 час., вытирают чистым полотенцем и сохраняют до употребления в широкогорлых банках в смеси спирта с эфиром (поровну). Перед употреблением стекла извлекают пинцетом и, не касаясь их поверхности, насухо вытирают.
Приготовление свежего препарата. Небольшую каплю крови помещают на предметное стекло, осторожно, стараясь не повреждать клеток, покрывают покровным и немедленно исследуют под микроскопом. Этим методом пользуются иногда для обнаружения трипанозом, спирохет, микрофилярий. Для более детального исследования пользуются сухими препаратами (мазками).
Приготовление мазка. Небольшую каплю крови, добытую путем укола, помещают на предметное стекло ближе к краю и размазывают тонким слоем при помощи шлифованного или покровного стеклышка. С этой целью стеклышко ставят впереди капли под углом 45° и осторожно к ней подходят так, чтобы оно лишь слегка коснулось окружности капли. Как только поверхность стекла коснется капли, часть крови быстро распределится в образовавшемся между стеклами углу. В эгот момент легким движением руки стеклышко передвигают вперед.
Кровь, следуя за стеклом, покрывает поверхность предметного стекла ровным и тонким слоем. Обычно приготовляют несколько (5—8) мазков, чтобы при просмотре выбросить все негодные. Хороший мазок должен быть достаточно длинным, тонким, равномерным, несколько уже предметного стекла, должен иметь параллельные края и ровный конец.
Высушивание мазка. Приготовленные мазки высушиваются на воздухе. В холодное время года можно для более быстрого высушивания подогреть мазок на подогревательном столике или провести стекло через пламя спиртовой горелки.
Фиксация мазка. Для фиксации мазок погружают в метиловый спирт, налитый в кюветку; хороший метиловый спирт фиксируют в течение 5 мин. Иногда в качестве фиксаторов пользуются абсолют-ным этиловым спиртом (20—30 мин.), смесью спирта с эфиром (аа partes 10—20 мин.) или чистым ацетоном. Предварительной фиксации не требует окраска по Лейшману.
Обозначения мазка. Датируют мазки с помощью булавки или пера, отмечая на середине мазка кличку или бирку животного, время приготовления и номер мазка. Приготовленные препараты или немедленно окрашивают, или пересылают для окраски в лаборатории, завернув их в фильтровальную бумагу таким образом, чтобы поверхности мазков не соприкасались непосредственно друг с другом.
Окраска по Романовскому — Гимза. Фиксированный ранее мазок прикрывают свежеприготовленным раствором краски Романовского — Гимза (1 -капля на 1 мл дестиллированной воды) и окрашивают в течение 15—25 мин. Красящий раствор смывают осторожно струей нейтрализованной дестиллированной воды и высушивают в вертикальном положении на воздухе. Ядра лейкоцитов окрашиваются в темнофиолетовый цвет, протоплазма лимфоцитов — в небесно-голубой, зернистость эозинофилов — в интенсивно-красный, гранулки оазофилов — в темный, зернистость и протоплазма нейтрофилов — в розовый (у лошади окрашивается очень слабо).
Окраска по Лейшману не требует предварительной фиксации. Мазок покрывают краской Лейшмана, которую наносят при помощи капельницы (15—20 капель) и через 5 мин. осторожно прибавляют, не смывая краски, равное же количество дестиллированной воды.
Жидкость тщательно перемешивают стеклянной палочкой или кисточкой и оставляют над мазком в течение 10 мин. Через 10 мин. раствор удаляют струей дестиллированной воды и высушивают обычным образом.
Источник: techpharm.ru
Принципы современных методов подсчета форменных элементов крови и определения содержания гемоглобина в современных гематологических анализаторах
[5] Исследование крови — один из важнейших методов оценки состояния функции кроветворения и диагностики многих заболеваний.Обычный общий клинический анализ крови предоставляет в распоряжение врача одновременно следующие показатели: концентрацию гемоглобинаколичество эритроцитов, цветовой показатель, количество лейкоцитов с подсчетом лейкоцитарной формулы, скорость оседания эритроцитов. В современных гемоанализаторах для подсчета клеток крови используется принцип проточной цитометрии с кондуктометрическим и/или оптическим методами регистрации сигналов прохождения суспензии форменных элементов через суженный участок капилляра со скоростью до 30 м/с.
1. Кондуктометрический метод регистрации, основан на измерении разницы электропроводности клеток крови и используемого для разбавления жидкости (электролита). Причем этот метод позволяет не только подсчитать количество клеток, но и охарактеризовать объем каждой проходящей через апертурное отверстие клетки, поскольку амплитуда сигнала пропорциональна объему замещенного электролита. Определение объемов позволяет дифференцировать эритроциты и тромбоциты, а после лизиса клеток проводить подсчет лейкоцитов по их ядрам, а также дифференцировать лейкоциты по размерам ядер на малые и большие. Измерение объемов клеток позволяет рассчитать их средний объем и степень анизоцитоза, а также построить гистограммы распределения основных клеточных популяций по их объему. Кроме того, в результате суммирования прямо измеренных объемов эритроцитов в единице объема крови можно получить показатель гематокрита.
2. Оптического метод. Анализ колебаний интенсивности проходящего через раствор крови светового потока в результате его частичного поглощения и рассеивания клетками крови, а также их флюоресценции после предварительного добавления к ним специальных красителей. В качестве источников света и для возбуждения флюоресценции используют газовые лазеры или дуговые ртутные лампы. Сигналы регистрируют по 5 параметрам: прямое светорассеяние (под углом 0,5-2°) для оценки размеров клетки; угловое светорассеяние (под углом 15-150°) для изучения гранулярности цитоплазмы; ослабление осевого света (светопоглощение) для анализа размеров и плотности клеток; флюоресценция (в том числе поляризация (поляризация света лазера) флюоресценции и анализ флюоресцентных сигналов волновой формы) для изучения специфических клеточных компонентов, структур, ферментов и т. д. Оптический метод дает возможность производить дифференциальный подсчет всех основных типов лейкоцитов: эозинофилов, базофилов, нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов. Для определения содержания гемоглобина в большинстве гематологических анализаторов используется гемоглобинцианидный метод. Знание показателей гематокрита, гемоглобина и эритроцитов позволим рассчитать эритроцитарные индексы: средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците и среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците.
59. Значения некоторых морфологических показателей крови в норме и единицы их измерения: гематокрит; количество эритроцитов; среднее содержание гемоглобина в одном эритроците; средний объем эритроцитов: СОЭ: количество ретикулоцитов; содержание гемоглобина; количество тромбоцитов; количество лейкоцитоз.
ü Гематокрит – часть объема крови приходящегося на долю эритроцитов (форменных элементов): ♂ – 0.4-0.49 л/л, ♀ – 0.36-0.42л/л;
ü Количество эритроцитов: (3,9-5,1)10 12 /л, (3,7-4,9)10 12 /л;
ü Среднее содержание гемоглобина в одном эритроците: 25.4-34.6 пг;
ü Средний объем эритроцитов: 80-100 мкм 3 , 79-98 мкм 3 ;
ü СОЭ: ♂ – 1-10мм/ч, ♀ – 2-15мм/ч;
ü Количество ретикулоцитов: 0,5-1,2%;
ü Содержание гемоглобина: ♂ – 130-170 г/л, ♀ – 120-150 г/л;
ü Количество тромбоцитов: (150-450)×10 9 /л;
ü Количество лейкоцитов: (4-9)×10 9 /л;
60. Значения некоторых показателей гомеостаза в норме и единицы их измерения: рН венозной и артериальной крови; вязкость цельной крови и плазмы крови: общее содержание белка в плазме: общий объем крови в организме (в % от массы тела): осмотическое давление плазмы крови; онкотическое давление плазмы крови; содержание глюкозы в крови.
ü рН венозной крови 7,34;
ü рН артериальной крови 7,4;
ü вязкость цельной крови 4,5-5,0 по отношению к вязкости воды, принятой за 1.0;
ü вязкость плазмы крови 1,8-2,2 по отношению к вязкости воды, принятой за 1,0;
ü общее содержание белка в плазме 60-85 г/л;
ü общий объем крови в организме человека 6-8% от массы тела;
ü осмотическое давление плазмы крови 290±10 мосмоль/кг (7,3 атм. Или 5600 мм рт. ст., или 745 кПа);
ü онкотическое давление плазмы крови 25-30 мм рт. ст.;
ü содержание глюкозы в крови 3,33-5,55 ммоль/л.
studopedia.org — Студопедия.Орг — 2014-2018 год. Студопедия не является автором материалов, которые размещены. Но предоставляет возможность бесплатного использования (0.002 с) . 
Источник: studopedia.org
Подсчет форменных элементов крови;
Лейкоцитарная формула здорового человека и метод ее определения.
Процентное соотношение отдельных видов лейкоцитов в периферической крови. Определяют гистологическим методом: микроскопия сухого окрашенного мазка крови.
(а) Подсчет эритроцитов.
Кровь разводят в 200 раз, используя 3% раствор NaCl. Подсчёт клеток проводят в камере Горяева, где объём разбавленной крови над одним маленьким квадратом составляет 1/20*1/20*1/10 = 1/4000 мм 3 (или мкл).
При большом увеличении микроскопа считают количество клеток в 80 маленьких квадратах. В каждом квадрате считают клетки, находящиеся внутри квадрата, а также клетки, попавшие на верхнюю и левую его стороны.
Формула для расчета количества эритроцитов в 1 мкл:
Кол-во клеток в 80 мал кв.*200*4000/80
Нормальный показатель – 4-5 млн в мкл (или 4-5*10 12 в литре)
(б) Подсчёт лейкоцитов.
Кровь разводят в 20 раз раствором уксусной кислоты (для гемолиза клеток) с добавлением метиленовой сини (для окрашивания ядер лейкоцитов). Подсчёт проводят под малым увеличением микроскопа в 25 больших квадрат, что составляет 400 малых квадратиков.
Формула для расчёта количества лейкоцитов в 1 мкл:
Кол-во клеток в 400 мал.кв.*20*4000/400
Нормальный показатель – 6-9 тыс в мкл (или 6-9*10 9 в литре)
4. Методы определения времени свёртывания крови и остановки кровотечения.
(а) Определение времени остановки кровотечения.
Этот показатель характеризует состояние первичного (сосудисто-тромбоцитарного) гемостаза. Используется видоизмененный метод Дюке: после неглубокого прокола пальца через каждые 20-30 сек промокают каплю выступившей крови с помощью фильтровальной бумаги до полной остановки кровотечения. Нормальный показатель – 1-3 минуты.
(б) Определение времени свёртывания крови.
Этот показатель характеризует состояние вторичного (коагуляционного) гемостаза. Используется метод Сухарева: в среднюю часть стеклянного капилляра помещают столбик крови и, периодически наклоняя капилляр, отмечают время до того момента, когда кровь перестанет перетекать по капилляру. Нормальный показатель – 5-10 минут (зависит от температуры воздуха в лаборатории).
5. Методы оценки внешнего (протромбиновое время) и внутреннего (АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время) путей коагуляционного гемостаза.
ПРОТРОМБИНОВОЕ ВРЕМЯ (ПТВ)
Цитратную кровь центрифугируют. К образцу плазмы добавляют избыток кальция, чтобы восстановить её способность свёртываться. Добавляют тканевой фактор (ТФ III) и засекают время до образования сгустка.
В норме ПТВ = 11 – 16 сек.
ПРОТРОМБИНОВЫЙ ИНДЕКС (ПТИ)
рассчитывают как отношение ПТВ контрольной плазмы к ПТВ плазмы пациента. ПТИ выражают в процентах.
АКТИВИРОВАННОЕ ЧАСТИЧНОЕ ТРОМБОПЛАСТИНОВОЕ ВРЕМЯ
К цитратной плазме пациента добавляют не тканевой фактор, а каолин и фосфолипиды, чтобы активировать внутренний путь образования протромбиназы. Затем добавляют кальций и измеряют время до образования сгустка. В норме АЧТВ = 25 – 39 сек
Для нормального АЧТВ необходимы факторы I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII. Чтобы выяснить, какого ф-ра нет в плазме пациента, его плазму смешивают с разными плазмами, дефицитными по разным ф-рам свёртывания. Свёртывание не произойдёт только в том случае, если в диагностической плазме и плазме пациента отсутствует один и тот же фактор.
Источник: studopedia.su