Рефрактометрическое определение общего белка в сыворотке крови вывод

Белки сыворотки крови представляют собой гетерогенную группу белков, включающую транспортные белки, ферменты, иммуноглобулины, гормоны, белки-ингибиторы и многие другие. Несмотря на различия в составе, структуре, физических и химических свойствах и выполняемой функции, белкам сыворотки присущ ряд общих характеристик:

1. содержат атомы углерода, водорода, кислорода, азота;
2. состоят из аминокислот, соединенных пептидными связями;
3. обладают поглощением в ультрафиолетовой области спектра;
4. сходно ведут себя в ряде химических реакций.

Исходя из этих общих свойств и были разработаны методы определения белка в биологических жидкостях.

Среди методов определения концентрации общего белка можно выделить несколько основных групп, основанных на различных принципах:

• азотометрические;
• гравиметрические (весовые);
• «преципитационные»;
• спектрофотометрические;
• рефрактометрические;
• колориметрические.

Кроме перечисленных выше разработаны также другие методы, например, флюориметрические, поляриметрические, а также методы атомно-абсорбционной спектрофотометрии и аминокислотного анализа белка.

Азотометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на определении количества белкового азота, образующегося при разрушении аминокислот, входящих в состав белков. Впервые метод был предложен Кьельдалем в 1883 году. В методе Кьельдаля, в настоящее время представляющем в целом исторический интерес, азот, содержащийся в составе белков, окисляют до иона аммония и его количество определяют титрованием точным раствором соляной кислоты. Кроме того, ион аммония может быть определен реактивом Несслера, манометрическим методом после превращения иона аммония в молекулярный азот под действием гипобромита или с помощью оптического теста Варбурга при участии фермента глутаматдегидрогеназы. Исходя из того, что белки из биологических объектов содержат в среднем 16 % азота, полученное в результате анализа количество азота умножают на коэффициент 6,25. Исторически используют фактор 6,25, хотя его величина зависит от белкового состава исследуемого образца. Для отдельных фракций белка в сыворотке или плазме величина фактора колеблется в диапазоне от 5,69 до 6,52.

Недостатком азотометрических методов является длительность и сложность процедуры, даже при том, что аммиак, образующийся в реакции, можно определять ферментативным методом. Автоматизация позволяет использовать этот метод в ряде случаев в качестве метода сравнения из-за его достаточной точности и воспроизводимости.

Гравиметрические (весовые) методы определения общего белка сыворотки основаны на высушивании белков до постоянной массы и взвешивании на аналитических весах. Методы трудоемки и в настоящее время практически не используются для определения общего белка сыворотки. Гравиметрический метод продолжает использоваться в некоторых лабораториях для определения фибриногена в плазме крови.

«Преципитационные» методы определения общего белка основаны на снижении растворимости белков и образовании суспензии взвешенных частиц под воздействием различных агентов. О содержании белка в исследуемой пробе судят либо по интенсивности светорассеяния (нефелометрический метод анализа), определяемого числом светорассеивающих частиц, либо по ослаблению светового потока образовавшейся суспензией (турбидиметрический метод анализа).

Результаты данной группы методов зависят от множества факторов: скорости смешивания реактивов, температуры реакционной смеси, значения рН среды, присутствия посторонних соединений, способов фотометрии. Тщательное соблюдение условий реакции способствует образованию стабильной суспензии с постоянным размером взвешенных частиц и получению воспроизводимых результатов. «Преципитационные» методы для определения белка в сыворотке крови не получили признания и нашли применение при определении белка в моче, спинномозговой жидкости и многих индивидуальных белков с использованием специфических антител.

Спектрофотометрические методы определения общего белка сыворотки крови основаны на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области.

Растворы белка обладают поглощением при 270–290 и 200–225 нм. Поглощение при 270–290 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот — тирозина, триптофана и фенилаланина. Поглощение при 200–225 нм практически в 20 раз выше, чем при 280 нм, и обусловлено главным образом пептидными связями.

Точность и специфичность методов определения белка, основанных на поглощении при 270 –290 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках сыворотки крови. Кроме того, присутствие в сыворотке свободных аминокислот — тирозина и триптофана, мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определенную погрешность. В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке.

Напротив, поглощение в ультрафиолетовой области — 200 – 225 нм обусловлено в основном пептидными связями, в связи с чем величина поглощения различных белков сыворотки различается незначительно. В этом спектральном диапазоне закон Бера соблюдается при концентрации белка в сыворотке до 120 г/л.

Определение общего белка сыворотки крови с помощью прямой фотометрии при 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. В то же время данный метод практически не применяется из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод.

Рефрактометрические методы определения общего белка сыворотки основаны на способности растворов белка к преломлению светового потока. При температуре 17,5 °С показатель преломления воды равен 1,3332, при той же температуре показатель преломления сыворотки колеблется в пределах 1,3480–1,3505. В связи с тем, что концентрация электролитов и небелковых органических соединений, влияющих на ее преломляющую способность, невелика и достаточно постоянна в сыворотке здорового человека, величина показателя преломления сыворотки крови зависит в первую очередь от содержания в ней белков. Калибровку прибора проводят сывороткой с известной концентрацией белка. Простота делает рефрактометрию удобным методом для определения содержания общего белка в сыворотке крови, хотя при ряде заболеваний, в частности, при сахарном диабете, хронической почечной недостаточности его использование может приводить к существенной ошибке.

Колориметрические методы определения общего белка основаны на цветных реакциях белков с хромоген-образующими реактивами или на неспецифическом связывании красителя.

Среди колориметрических методов определения концентрации общего белка сыворотки наиболее распространенным считается биуретовый метод, основанный на так называемой «цветной биуретовой реакции», в ходе которой белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием соединений, окрашенных в фиолетовый цвет, интенсивность окраски зависит от концентрации общего белка в сыворотке. Биуретовый метод определения общего белка в сыворотке крови был утвержден в качестве унифицированного в 1972 г.

Колориметрические методы определения общего белка сыворотки крови достаточно просты и относительно дешевы. К недостатку метода относится интерферирующее действие некоторых веществ (в том числе лекарств).

Флюориметрические и другие современные методы определения общего белка (например, поляриграфический микрометод или атомно-абсорбционный анализ) обладают высокой чувствительностью и специфичностью, однако необходимость ввода специальной аппаратуры, а иногда и специальной квалификации аналитика наряду с достаточно высокой стоимостью определения делает этот метод достоянием научно-исследовательских учреждений и значительно ограничивает его использование в клинической лаборатории.

• Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под редакцией Меньшикова В. В. — Москва, «Медицина», 1987 г
• А.В. Козлов А. В., Слепышева В. В. — Определение белка в сыворотке крови.
• Медицинская биохимия: Лабораторный практикум под редакцией Семиколеновой Н. А. — Омск, издательство ОмГУ, 2005 г

Для количественного определения белка пригоден любой образец мочи. Большинство исследователей для выяснения величины суточной потери белка предпочитают определять содержание белка в моче, собранной за сутки.

Раздел: Анализ мочи

Под термином общий белок сыворотки крови понимается большое количество белков, присутствующих в сыворотке крови и различающихся между собой по структуре, физико-химическим свойствам, функции. Все белки сыворотки крови делят на альбумин и глобулины. В плазме крови помимо альбумина и глобулинов содержится также фибриноген, поэтому содержание общего белка в плазме крови несколько выше, чем в сыворотке.

Раздел: Клиническая биохимия

Определение общего белка по биуретовой реакции является на сегодняшний день самым распространенным методом определения общего белка в сыворотке крови. Метод относительно дешев, прост, обладает хорошей воспроизводимостью и специфичностью, использование его позволяет выполнять исследование как на анализаторах (автоматических и полуавтоматических), так и на обычном фотометре.

Раздел: Клиническая биохимия

Патологическая протеинурия является одним из наиболее важных и постоянных признаков заболеваний почек и мочевых путей. Определение концентрации белка в моче является обязательным и важным элементом исследования мочи.

Раздел: Анализ мочи

Фотометрические методы определения мочевины основаны на реакции мочевины с различными веществами с образованием окрашенных соединений. Среди фотометрических методов определения мочевины наиболее распространенными являются методы, основанные на реакции мочевины с диацетилмонооксимом.

Раздел: Клиническая биохимия

По материалам www.clinlab.info

Принцип метода. В основе рефрактометрии лежит неодинаковая способность различных сред преломлять проходящие через них лучи света. Отношение синуса угла падения к синусу угла преломления называется показателем (коэффициентом) преломления:

Степень рефракции раствора обусловлена количеством, размерами и физическим состоянием растворённых в нём частиц, а также температурой окружающей среды. В сыворотке крови величина рефракции зависит в первую очередь от количества и качества белков; солям и другим составным частям принадлежит меньшая роль. Для определения показателя преломления служат особые приборы – рефрактометры. Схема устройства рефрактометра на рис. 1.

Рис. 1. Схема устройства рефрактометра.

1 – зеркало; 2 и 4 – призмы; 3 – сыворотка; 5 – окуляр; 6 – белое и тёмное поле в окуляре; 7 – шкала для отсчёта поворота угла призм, показатель преломления (рефракция).

Оборудование и исследуемый материал:

1. Рефрактометр 2. Фильтровальная бумага 3. Сыворотка и вода

Расчёт. Определив показатель преломления по таблице, вычисляют процент содержания белка в испытуемой пробе (г/100 мл). Коэффициент пересчета в единицы СИ (г/л) равен 10.

Примечания. Чувствительность метода невелика (0,5-1%).

Таблица. Вычисление процентного содержания белка по показателю преломления

Клинико-диагностическое значение: повышение содержания белка в крови (гиперпротеинемия) наблюдается при венозном стазе, гипогидратации, гипериммуноглобулинемии; снижение уровня белка в крови (гипопротеинемия) ниже 60 г/л может быть связано с потерей белка (при гастроэнтеропатиях, ожогах, нефротическом синдроме) и снижением синтеза белка (при тяжелой белковой недостаточности, хронических заболеваниях печени). Норма (сыворотка) — 65-85 г/л.

Рисунок. Электрофореграмма белков сыворотки крови и состав белковых фракций.

Задания для контроля уровня сформированности компетенций в учебное время.

· Какие вещества в крови транспортируются в комплек­се с белками?

· Объясните механизм развития голодных отеков.

· Как может измениться уровень альбуминов плазмы при поражении печени? Почему?

· Почему анализируют состав венозной, а не артериальной крови?

· Каковы основные физиологические функции крови?

· Какие белки плазмы крови играют основную роль в поддержании на определенном уровне онкотического давления?

· Какие небелковые органические вещества содержатся в крови?

· В чем состоит диагностическая ценность определения общего белка, остаточного азота, ферментов (ЩФ, амилазы, АлАТ, АсАТ, ЛДГ) сыворотки крови.

По материалам studopedia.su

Для рефрактометрического определения общего белка необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Штатив для пробирок.
2. Пастеровские пипетки.
3. Центрифужные пробирки (желательно толстостенные с широким донышком).
4. Стеклянные палочки.
5. Водяная баня.
6. Рефрактометр марки РЛУ (Киев).

Для проведения электрофореза на бумаге необходимо следующее оснащение рабочего места:

1. Аппарат для электрофореза (ЭФА-1).
2. Пробирки.
3. Колбочки на 50 мл.
4. Пипетки на 10 мл.
5. Микропипетки.
6. Стеклянная рамка.
7. Сушильный шкаф.
8. Кюветы.
9. Ножницы.
10. Фотоэлектроколориметр (ФЭК).
11. Мединал.
12. Веронал.
13. Бромфеноловый синий.
14. Сулема (HgCl2).
15. Ледяная уксусная кислота.
16. Едкий натр.
17. Хроматографическая бумага № 1.

Для исследования необходима сыворотка крови.

Сущность метода состоит в определении коэффициента преломления сыворотки, величина которого зависит от содержания в ней общего белка. Коэффициент преломления сыворотки устанавливают с помощью специального прибора — рефрактометра (рис. 85). Для этого метода необходимы следующие реактивы:

1. Насыщенный раствор сернокислого аммония: 75,4 г химически чистого (NH4)2S04 растворяют в 100 мл воды.
2. 0,04 N раствор уксусной кислоты: 2,28 мл ледяной уксусной кислоты разводят в воде и объем раствора до¬водят водой до объема 1 л.

Рис. 85. Общий вид рефрактометра (а), горизонтальное положение камеры (б)

Для определения нулевой точки рефрактометра камеру со зрительной трубкой переводят в горизонтальное положение (см. рис. 85, б). Приподнимают верхнюю половину камеры и на призму наносят 1-2 капли дистиллированной воды. Закрывают камеру. С помощью зеркала направляют свет в окно камеры. Поворотом винта достигают резкой границы светотени. Окуляр шкалы и окуляр зри¬тельной трубки устанавливают на резкость. Линию окуляра шкалы устанавливают на 1,3330 и в зрительную трубку наблюдают границы светотени по отношению к точке пересечения двух взаимно перпендикулярных линий. Совпадение границы светотени с точкой пересечения линии указывает на то, что прибор установлен на нуль. При несовпадении границы светотени на корпусе зрительной трубки с помощью ключа и маленького винта ставят границу светотени на точку пересечения линий. Обе призмы камеры вытирают фильтровальной бумагой, а затем досуха протирают мягкой неворсистой тряпочкой.

На поверхность призмы наносят 1-2 капли исследуемой сыворотки крови и быстро закрывают камеру. Поворачивают камеру до момента совпадения границы светотени с точкой пересечения двух линий. Этот момент устанавливают при наблюдении через окуляр. По шкале производят отсчет показателя коэффициента преломления сыворотки и по табл. 12 устанавливают содержание белка в процентах.

Так, например, если показатель коэффициента преломления сыворотки равен 1,34388, то ему по таблице соответствует 4,6% белка.

После определения обе призмы тщательно промывают дистиллированной водой и досуха протирают фильтровальной бумагой и мягкой тряпочкой.

В сыворотке крови здоровых людей содержится от 6 до 8.5% общего белка.

В штатив устанавливают четыре пронумерованные центрифужные пробирки с пробками. В пробирки № 1 и 3 наливают по 1 мл 0,04 N раствора уксусной кислоты. В пробирки № 1 и 2 наливают по 1 мл исследуемой сыворотки крови. Затем в пробирки № 3 и 4 вносят по 1 мл дистиллированной воды и этой же пипеткой, промытой несколько раз насыщенным раствором сернокислого аммония, в пробирки № 2 и 4 вносят по 1 мл насыщенного раствора, после чего все пробирки тотчас же закрывают пробками.

Содержимое пробирок взбалтывают, поколачивая их о ладонь, не менее 20 раз (все пробирки взбалтывают одинаковое число раз), после чего содержимое пробирки № 1 кипятят в водяной бане в течение 3 минут. Отделив свернувшийся белок от стенок пробирки стеклянной палочкой, смесь центрифугируют не менее 5 минут (1500-2000 об/мин). Центрифугат должен быть прозрачным.

Содержимое пробирки № 2 центрифугируют в течение 20-30 минут, центрифугат также должен быть прозрачным. Затем с помощью рефрактометра определяют коэффициент преломления реактивов каждой пробирки в отдельности.

Определение начинают с пробирки № 3, в которой 0,04 N раствор уксусной кислоты разведен в 2 раза дистиллированной водой, и № 4, содержащей насыщенный раствор сернокислого аммония, разведенный в 2 раза дистиллированной водой. Вслед за тем определяют коэффициент преломления центрифугата в пробирке № 1. Центрифугат этой пробирки не содержит белков, поскольку прибавление к сыворотке крови 0,04 N раствора уксусной кислоты и последующее кипячение содержимого пробирки ведут к осаждению белка.

В последнюю очередь определяют коэффициент преломления центрифугата пробирки № 2 (этот центрифугат содержит только альбумины, так как добавление насыщенного раствора сернокислого аммония приводит к осаждению глобулинов).

При определении коэффициента преломления каплю содержимого из каждой пробирки наносят на призму рефрактометра чистой сухой пастеровской пипеткой. После каждого определения призму промывают водой и протирают досуха фильтровальной бумагой и мягкой тряпочкой.

Определение производят при температуре 20°. При необходимости создают постоянную температуру, пропуская с помощью имеющегося в приборе приспособления проточную воду температурой 20°.

В результате исследования могут, например, получиться следующие показатели:

1. Коэффициент преломления цельной сыворотки (общий белок) — 1,3490.
2. Коэффициент преломления воды (величина постоянная) — 1,3330.
3. Коэффициент преломления безбелкового центрифугата —1,3340 (пробирка № 1).
4. Коэффициент преломления альбуминов — 1,3758 (пробирка № 2).
5. Коэффициент преломления 0,04 N раствора уксусной кислоты — 1,3331 (пробирка № 3).
6. Коэффициент преломления полунасыщенного раство¬ра сернокислого аммония — 1,3710 (пробирка № 4).

Перевод коэффициента преломления, установленного по шкале рефрактометра, в проценты белка производят по таблице Рейсса (см. табл. 12).

Пример расчета.

1. Если коэффициент преломления цельной сыворотки равен 1,3490, то по таблице Рейсса он соответствует 7,63% общего белка.

2. Чтобы определить процентное содержание альбуминов, поступают следующим образом:

• коэффициент преломления альбуминов по шкале рефрактометра 1,3758; из коэффициента преломления альбуминов вычитают показатель преломления насыщенного раствора сернокислого аммония: 1,3758—1,3710 = 0,0048; ввиду разведения насыщенного раствора (NH4)2S04 в 2 раза полученный результат умножают на 2: (0,0048X2 = = 0,0096);
• определяют истинное преломление безбелковых веществ — из показателя преломления безбелковых веществ вычитают показатель преломления разведенного вдвое 0,04 N раствора — СНзСООН: 1,3340-1,3331 = 0,0009; 0,0009X2 = 0,0018;
• определяют истинное преломление альбуминов — из коэффициента преломления альбуминов (0,0096) вычитают коэффициент преломления безбелковых веществ, 0,0096-0,0018 = 0,0078;
• определяют содержание альбуминов — коэффициент истинного преломления альбуминов делят на 0,00177 — коэффициент преломления 1% раствора альбуминов: 0,0078:0,00177 = 4,4%.

3. Чтобы определить содержание глобулинов, суммарный коэффициент преломления воды, безбелковых веществ и альбуминов вычитают из коэффициента преломления цельной сыворотки (общего белка) и делят на 0,00229 — коэффициент преломления 1% раствора глобулинов: а) 0.0096 + 1.3330=1,3426; б) 1,3490-1,3426 = 0,0064; в) 0,0064:0,00229 = 2,8%.

4. Для определения коэффициента соотношения альбуминов и глобулинов показатели содержания альбуминов делят на содержание глобулинов.

Сущность метода состоит в разделении белков сыворотки на бумаге с помощью электрофореза. Разделенные белки выявляются с помощью обработки полосок бумаги специальными красителями, при этом удается выделить альбумины и фракции глобулинов.

Для этого метода пользуются следующими реактивами:

1. Вероналовый буфер (рН 8,6): 10,32 г мединала растворяют в мерной колбе на 1 л в 800 мл дистиллированной воды с добавлением 1,84 г веронала. Смесь нагревают на водяной бане до растворения веронала, а затем охлаждают; объем раствора доводят до 1 л.
2. Краситель для окраски электрофореграмм: бромфенолового синего 0,05 г, сулемы 1 г, ледяной уксусной кислоты 2 мл, дистиллированной воды 98 мл.
3. 2% раствор уксусной кислоты — 2 мл ледяной уксусной кислоты на 100 мл раствора.
4. 0,1 N раствор NaOH: 2 г едкого натра помещают в мерную колбу на 500 мл и доливают водой до метки.
5. 0,01 N раствор NaOH: 10 мл 0,1 N NaOH помещают в колбочку на 100 мл и доводят до метки дистиллированной водой. Этот реактив готовится перед началом исследования.
6. Хроматографическая бумага № 1.

Устанавливают аппарат для электрофореза согласно указаниям инструкции к прибору. Затем хроматографическую бумагу № 1 нарезают на полоски размером 4 X 44 см, в центре бумажных полосок простым карандашом наносят одну поперечную черту, а на расстоянии 4 см от нее — другую. С этой же стороны, у конца бумажной полоски, карандашом надписывают дату исследования и фамилию обследуемого.

Подготовленную таким образом полоску бумаги равномерно натягивают на рамку прибора, которую помещают в камеру, предварительно заполненную буферным раствором. Концы бумажных полосок должны быть погружены в буферный раствор. При этом та часть бумажной полоски, на которой помечена фамилия обследуемого и дата исследования, должна быть обращена к катоду. Прибор закрывают крышкой и выжидают, пока бумажные полоски пропитаются буферным раствором. После этого крышку снимают и на черту, находящуюся на расстоянии 4 см от черты, проведенной карандашом в центре полоски, микропипеткой наносят 0,01-0,005 мл исследуемой сыворотки.

Если, например, необходимо нанести 0,01 мл сыворотки, то в микропипетку на 0,1 мл набирают 0,085 мл сыворотки и, едва касаясь полоски бумаги, осторожно спускают взятую сыворотку до метки 0,095 мл, распределяя ее по всей длине черты.

Наносить сыворотку у самых краев бумаги не следует.

После нанесения сыворотки прибор закрывают крышкой и подключают к сети. Электрофорез проводят при комнатной температуре. Хорошее разделение сыворотки происходит при 127—210 V в течение 18 часов. По окончании электрофореза ток выключают, крышку снимают, бумажные полоски извлекают, подвешивают горизонтально на специальной рамке (рис. 86) и помещают на 20 минут в сушильный шкаф при температуре 105°. Затем их погружают в кювету с красителем и окрашивают в течение 20 минут бромфеноловым синим. Краситель сливают, а электрофореграммы последовательно в нескольких порциях промывают в 2% растворе уксусной кислоты до тех пор, пока фон фореграммы полностью не отмоется от красителя (рис. 87). Во время окраски и отмывания полоски хроматографической бумаги не должны сворачиваться и накладываться друг па друга. В результате окраски на ленте выявляются окрашенные участки, соответствующие альбуминам альфа, бетта и гамма-глобулинам.

Рис. 86. Стеклянная рамка для подвешивания бумаги

После отмывания полоски бумаги высушивают при комнатной температуре и разрезают на отдельные участки, соответствующие отдельным белковым фракциям.

При этом участки, относящиеся к альбуминовой фракции, помещают в отдельную колбочку на 50 мл, а участки, относящиеся к аг-, fi- и у-глобулинам, — в отдельные химические пробирки. К альбуминовому участку добавляют 30 мл, а к глобулиновым — по 10 мл 0,01 N раствора NaOH для извлечения (элюции) белка, окрашенного бромфеноловым синим.

Участок электрофореграммы, не содержащей белка, разрезают на кусочки шириной 1-1,5 см, помещают в отдельную химическую пробирку, предназначенную для контроля, и добавляют 10 мл 0,01 N раствор NaOH.
Колбочку и пробирки оставляют на один час при комнатной температуре для полноты извлечения.

Сразу же после окончания элюции определяют интенсивность окраски элюатов на фотоэлектроколориметре, пользуясь правым барабаном, при красном светофильтре. Кюветы используют с расстоянием рабочих граней 20 мм, колориметрирование ведут против контроля (элюат фонофореграммы).

Экстинкцию, полученную при колориметрировании фракции альбуминов, умножают на 3 в связи с тем, что для элюирования этой фракции было использовано 30 мл 0,01 N раствора щелочи.

Найденные для каждой фракции величины экстинкций складывают. Полученную сумму принимают за 100%. Например: экстинкция альбуминов 0,135X3 = 0,405;

Сумма экстинкций — 0,405 + 0,048 + 0,065 + 0,075 + + 0,080 = 0,673.

Принимая сумму за 100%, рассчитываем содержание каждой фракции в процентах. Содержание остальных фракций рассчитывают аналогичным образом.

Нормальное содержание белковых фракций в сыворотке крови в процентах составляет: альбумины 53-63; альфа1-глобулины 3,8-6,2; альфа2-глобулины 6,5-10,5; бетта-глобулины 10,0-15; гамма-глобулины 14,5-19,5.

По материалам ginekolog.my1.ru

1. В чем состоят особенности переваривания и всасывания жиров у различных видов животных и рыб?

2. Какие вещества можно обнаружить в моче при нарушении тканевого обмена липидов?

3. Протекание каких процессов в организме может привести к понижению или повышению концентрации свободных жирных кислот в крови?

4. Как влияют жиры пищи на состав резервных жиров?

5. Напишите схему ресинтеза пальмитолеостеарина в слизистой кишечника.

Белки являются основной составной частью протоплазмы. Обмен белков в общем обмене веществ занимает ведущее место.

Белки обеспечивают воспроизводство основных структурных эле-

ментов клеток, тканей и органов, выполняют регуляторную, каталити-

ческую, транспортную, защитную и энергетическую функции.

Питательная ценность белка для животных организмов определяется аминокислотным составом. Белок считается полноценным, если содержит все жизненноважные аминокислоты (незаменимые). Одного грамма такого белка достаточно для восстановления одного грамма тканевого белка.

Белок, поступая в составе пищи в организм, расщепляется в ЖКТ при участии группы протеолитических ферментов до смеси аминокислот. Аминокислоты всасываются и поступают вначале в печень. Часть аминокислот используется клетками печени для синтеза различных белков, а также превращения в гликоген (гликогенные кислоты) и липидов (кетогенные кислоты). Часть аминокислот разносится кровью дальше к различным органам и тканям и используется для синтеза специфических тканевых белков. Только незначительная часть аминокислот используется как энергетический материал.

Тканевое превращение аминокислот включает синтез заменимых аминокислот (в реакциях восстановительного аминирования и переаминирования), а из них далее пептидов и белков организма и расщепление аминокислот, образовавшихся в результате гидролиза устаревших биомолекул белка. Окисление аминокислот происходит вначале в реакциях декарбоксилирования и дезаминирования и заканчивается в цикле трикарбоновых кислот. В процессе декарбоксилирования образуются биогенные амины – вещества, обладающие сильным физиологическим действием. Поэтому тканевое декарбоксилирование аминокислот носит избирательный характер. Конечными продуктами распа-

да аминокислот в организме являются: аммиак, мочевая кислота, мочевина, углекислый газ и вода.

^ Цель занятия. Провести ферментативный гидролиз белка и обнаружить продукты гидролиза. Изучить особенности переваривания белка у различных видов животных и рыб. Познакомиться с методами количественного определения веществ белкового обмена.

^ Материалы и оборудование. Соляная кислота, 0,2% и 1% раствор; желудочный сок или 0,1% раствор пепсина в 0,2% соляной кислоте;

гидрокарбонат натрия, 1 % раствор; моноиодуксусная кислота, 0,002М в 0,1% растворе гидрокарбоната калия; гидроксид натрия 10% раствор; сульфат меди, 5% раствора; этиловый спирт, 75% раствор; нингидрин, 1 % раствор в 95% ацетоне; трихлоруксусная кислота, 10% раствор; насыщенный раствор гидроксида калия; салициловый альдегид, 2%

раствор; фибрин или коагулированный яичный белок; сухой размолотый биологический материал (ткань животного, фиксированная этанолом при нагревании и переведенная в сухой порошок), мышечная ткань, сыворотка крови.

Пробирки, пипетки на 1 и 5 мл, штативы, ступки, воронки, складчатые фильтры, чашки для выпаривания, термостат, водяная баня, рефрактометр.

^ Опыт 1. Переваривание белков пепсином. В желудочно-кишечном тракте животных расщепление белка до смеси аминокислот происходит при участии группы протеолитических ферментов (протеаз) по схеме:

Схема ферментативного гидролиза белка

желудок тонкий отдел кишечника

рН 1,5-2,5 рН8,0-9,5 карбокси-

(катепсин рН 4,40-5,0) химотрипсин

Белок  высокомолекулярные  низкомолекулярные 

+nН₂О полипептиды + mH₂O пептиды пептидазы

три- и дипептиды  смесь аминокислот

В реальных условиях на любом этапе гидролиза может образоваться часть свободных аминокислот, а часть непереварившихся белков и пептидов перейти в толстый отдел кишечника без изменения. Протеолитические ферменты синтезируются в неактивной форме. В активное состояние пепсин приводит соляная кислота, трипсинэнтерокиназа

(фермент слизистой кишечника), химотрипсин активируется активной формой трипсина.

Протеолитические ферменты расщепляют пептидные связи специфично. Пепсин производит гидролиз связей, образованных с одной стороны ароматическими, с другой – дикарбоновыми аминокислотами. Как правило, эти связи расположены далеко внутри полипептидной цепи.

Трипсин расщепляет пептидные связи, образованные между карбоксильной группой аргинина (лизина) и любой другой кислоты. Химотрипсин катализирует связи, образованные карбоксильной группой ароматических аминокислот и аминогруппой любой другой кислоты. Амино- и карбоксипептидазы отщепляют свободные аминокислоты с соответствующего конца пептидной цепи.

Действию пепсина поддаются почти все белки, но с трудом перевариваются белки соединительной ткани — коллаген и эластин. Кератины, муцин, мукоиды совсем не перевариваются. Это их свойство защищает стенки желудка от самопереваривания.

Нумеруют четыре пробирки и вносят в первую – 3-4 мл 0,2% раст-

вора соляной кислоты; во вторую – 3-4 мл желудочного сока (или раствора пепсина в НCl); в третью – 3-4 мл раствора пепсина, нейтрализованного предварительно до слабощелочной реакции раствором соды; в четвертую – 3-4 мл предварительно прокипяченного раствора пепсина. Затем во все четыре пробирки вносят равные по объему кусочки фибрина или коагулированного яичного белка. Все пробирки ставят в термостат на 45-60 минут при 37-40 о С. После термостатирования проделывают биуретовую реакцию. Для этого во все пробирки вносят по

1 мл 10% раствора NaOH и 2-3 капли 5% раствора сульфата меди, все встряхивают и наблюдают характерное окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, содержащие не менее двух пептидных связей. В щелочной среде белок реагирует с ионами меди с образованием биуретового комплекса фиолетового цвета. Интенсивность окраски зависит от концентрации белка. В реакцию с гидроксидом меди (II) полипептиды вступают в енольной форме, и фиолетовая

Cu–Na– комплексная соль полипептидов и белков имеет следующее строение:

NH₂–CH–CO–NH–CH–CO–NH–CH–COOH

NH₂–CH–C=N–CH–C=N–CH–COOH

Цвет комплекса зависит от длины пептидной цепи, тетрапептиды и более длинные цепи образуют комплекс красного цвета, трипептиды – фиолетовый, дипептиды – синий.

в ыводы по каждой из пробирок записать в тетрадь.

Опыт 2. Выделение свободных аминокислот из биологического материала. Свободные аминокислоты извлекают из биологического материала 75-80%-ным водным раствором этанола. Аминокислоты в вытяжке из биологического материала обнаруживают реакцией с нингидрином.

^ O

-аминокислота О альдегид О

нингидрин восстановленный нингидрин

(окисленная форма) (енольная форма)

ОН + О + NH₃  N + 2 Н₂О

При нагревании (до70 о С) -аминокислоты окисляются нингидрином и подвергаются окислительному дезаминированию и декарбоксилированию с образованием аммиака, углекислого газа и альдегида. Восстановленный нингидрин конденсируется с аммиаком и с молекулой окисленного нингидрина. В результате образуется соединение, енольная форма которого окрашена в сине-фиолетовый цвет.

В ступку помещают 2 г размолотого сухого биологического мате-

риала и заливают 10 мл 75%-ного раствора этилового спирта, нагретого до t 60-70 о С на водяной бане. Полученную смесь тщательно растирают в течение 15 мин и фильтруют через вставленный в воронку складчатый бумажный фильтр в чашку для выпаривания, используя ее в качестве приемника. Чашку помещают на кипящую водяную баню и полностью выпаривают спирт. Полученный сухой остаток растворяют в 1 мл раствора соляной кислоты и тщательно его растирают стеклянной палочкой в течение 10-15 мин. Для обнаружения аминокислот в вытяжке к 5 каплям смеси добавляют 2 мл дистиллированной воды (разводят вытяжку) и 3-4 капли раствора нингидрина. Полученную смесь тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане при

t 70 о С в течение 5 мин. Появляется сине-фиолетовая окраска, свидетельствующая о наличии в пробе -аминокислот.

Если плотность окраски вытяжки с нингидрином измерить с помощью колориметра и сопоставить с плотностью окраски нингидрином смеси -аминокислот известной концентрации, то можно рассчитать концентрацию -аминокислот в исследуемой пробе.

^ Опыт 3. Переаминирование между глутаминовой и пировиноградной кислотой. Пути образования заменимых аминокислот в организме разнообразны. Одноосновные аминокислоты могут образовываться путем декарбоксилирования двух основных. Путем восстановительного аминирования -кетокислот синтезируются преимущественно аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Другие аминокислоты образуются в результате реакций переаминирования или трансаминирования. В реакциях переаминирования происходит перенос аминогруппы между аминокислотами и -кетокислотами без промежуточного образования аммиака. В обмене белка переаминирование играет центральную роль. Это реакция распада одних аминокислот и

синтеза других. Все аминокислоты участвуют в этой реакции и именно реакции переаминирования создают необходимый организму набор аминокислот. Наиболее интенсивно процесс протекает при участии дикарбоновых аминокислот (аспарагиновой и глутаминовой) и соответствующих им -кетокислот. Катализируют реакции переаминирования аминотрансферазы (трансаминазы), коферментом которых выступает фосфопиридоксаль (В₆).

Изучить процесс переаминирования можно на примере переаминирования глутаминовой и пировиноградной кислот при участии фермента, содержащегося в мышцах. Об интенсивности реакции можно судить по убыли в результате переаминирования пировиноградной

кислоты, которая с салициловым альдегидом дает оранжевое окрашивание. В качестве источника фермента используют мышечный гомоге-

нат. Готовят его после подготовки реакционных смесей.

СООН аминотрансфераза СООН

глутаминовая ПВК -кетоглу- аланин

м ышечную ткань измельчают ножницами в фарфоровой чашке и растирают с пятикратным объемом 0,1% гидрокарбоната калия (лучше провести гомогенизацию в специальном гомогенизаторе). Полученный гомогенат фильтруют через двойной слой марли, отжимают и используют для опыта.

Реакционные смеси для опыта готовят в широких пробирках по

схеме, внося гомогенат в последнюю очередь.

^ Схема подготовки реакционных смесей

Раствор гидрокарбоната калия вносят для создания оптимального

рН. Монойодуксусную кислоту вносят для предотвращения гликолиза.

Пробу № 1 на инкубацию не ставят, мышечную кашицу помещают

только после внесения 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы № 2 и 3 после внесения гомогената перемешивают, ставят на инкубацию в термостат на 60-90 минут при температуре 37-40 о С, периодически встряхивая (через 5-10 минут). По окончании инкубации для удаления белка во 2 и 3 пробы вносят 1 мл трихлоруксусной кислоты и через 10 минут все три пробы фильтруют в отдельные пробирки. Отбирают по 1 мл безбелкового фильтрата из всех трех проб и в каждую вносят 1 мл насыщенного раствора гидроксида калия и

0,5 мл 2% раствора салицилового альдегида. Содержимое пробирок перемешивают и помещают на 10 минут в водяную баню (t 37-38 о С) для развития окраски.

Сравнивают окраску во всех трех пробах и делают выводы об интенсивности процесса переаминирования.

^ Опыт 3. Определение общего белка в сыворотке крови рефрактометрическим методом. Одним из методов определения общего белка в сыворотке крови является рефрактометрический метод.

В основе данного метода лежит способность исследуемого раствора преломлять проходящие из другой среды лучи света. Степень преломления света, или величина рефракции сыворотки крови, зависит в основном от содержания в ней белков. Поэтому количественно оценивая величину рефракции по показателю преломления сыворотки с помощью специального прибора – рефрактометра, можно определить содержание белков в сыворотке крови.

Перед началом работы проводят установку прибора на ноль (юстировку) по дистиллированной воде, коэффициент преломления которой равен 1, 333. Для этого на поверхность измерительной призмы наносят несколько капель воды и осторожно закрывают измерительную камеру. Осветительным зеркалом пучок света направляют через освети-

тельную призму так, чтобы он равномерно осветил поле зрения. Маховичком устанавливают индекс отсчета (неподвижный горизонтальный штрих сетки) на 1,333, винтом компрессора устраняют окрашенность границы светотени. При правильной настройке прибора граница раздела светлого и темного полей должна совпадать с визирным перекрестием.

Настроив прибор, тщательно вытирают воду в призме. Для определения общего белка сыворотки крови 1-2 капли ее наносят на измерительную призму и, глядя в окуляр, вращением маховичка совмещают границу темного и светлого полей с перекрестием визирных линий. Затем по шкале показателей преломления снимают отсчет.

Определив показатель преломления исследуемой сыворотки, по таблице Рейса находят соответствующее процентное содержание белка. Показатель преломления определяют при рассеянном дневном свете при 20 о С. Если показатель преломления определяют при какой-либо другой температуре, то вводят поправку на отклонения температуры. При отклонении температуры на 1 о С показатель преломления изменяется на 0,00035. При понижении температуры – поправка отнимается, а при повышении – прибавляется.

По окончании работы смывают водой с призм прибора сыворотку, удаляют воду фильтровальной бумагой и осушают призмы спиртоэфирной смесью. На нижнюю призму накладывают кусочек фильтро-

вальной бумаги и закрывают камеру. В таком состоянии прибор оставляют до следующего определения.

^ Содержание общего белка в сыворотке крови, г/л

Вывод: коэффициент рефракции исследуемой сывротки крови составил …., что по таблице соответствует ……… г/л белка.

1. Каково строение и биологическое назначение белков в живом организме?

2. От чего зависит питательная ценность белка?

3. В каких отделах ЖКТ и при участии каких ферментов происходит гидролиз белка?

4. В результате каких реакций происходит синтез и распад аминокислот в тканях? Подтвердите свой ответ написанием реакций декарбоксилирования и дезаминирования конкретной аминокислоты.

5. Существует ли взаимосвязь между процессами расщепления и синтеза аминокислот и в чем она проявляется?

6. Какими известными вам методами можно обнаружить и опреде-

лить содержание аминокислот и белка в биологическом материале?

^ 8. ОБМЕН МИНЕРАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ

В организме животных и сельскохозяйственной птицы содержится до 70 химических элементов, что составляет 2-5% от массы тела. Поступают они в организм в составе пищи и потребляемых жидкостей. В процессе пищеварения минеральные вещества усваиваются в основном в тонком отделе кишечника, часть может всасываться в желудке (преджелудках) и толстом отделе кишечника. Путем пассивной диффузии всасывается небольшая доля ионов, основная масса солей в виде ионов и катионов переносится активно с затратой энергии и контролируется нейрогуморальным путем.

В организме минеральные вещества избирательно откладываются в различных органах и тканях и извлекаются по мере необходимости, благодаря чему регулируется и поддерживается относительно посто-

янный состав тканей и жидкостей организма. Так в костной ткани сосредоточено до 99 % всех минеральных веществ организма прежде всего это катионы кальция и магния в виде апатитов, фосфатов, карбонатов, а также фтор, стронций, цезий, алюминий, свинец, олово и др. микроэлементы. В печени концентрируется железо, медь, кобальт, марганец, никель, молибден, селен. Кожа и мышцы накапливают натрий и калий.

В зависимости от содержания в организме различают группу макроэлементов и микроэлементов. К макроэлементам относят элементы,

содержание которых превышает сотые доли процента (фосфор, кальций, калий, магний, сера, хлор, натрий). Содержание микроэлементов в организме исчисляется тысячными и десятитысячными долями процентов (железо, кобальт, цинк, марганец, йод, бром, никель и др.). Как правило в организме больше тех элементов, которые образуют в воде растворимые соединения, чем тех, что не образуют в воде растворимых соединений.

Минеральные вещества присутствуют в организме в различных формах:

1) прочно связанные с органическими веществами ( s — в составе белка, Р – в нуклеиновых кислотах, Fe – в гемоглобине, Zn и Cu – в молекулах ферментов);

2) в форме нерастворимых отложений (Ca и Р в костной ткани);

3) в растворенном состоянии в биологических жидкостях и цитозо-

ле клеток (катионы К + , Na + , Mg 2+ , Ca 2+ , анионы Cl — , SO₄ 2- , PO₄ 3- ).

Основная роль минеральных веществ в организме заключается в регуляции кислотно-щелочного равновесия, проницаемости мембран, поддержании на постоянном уровне осмотического давления клеток, крови, лимфы. Минеральные вещества участвуют в построении и формировании молекул белка и других соединений, изменяют активность ферментов, отвечают за передачу нервного импульса.

Характерной особенностью обмена минеральных элементов является антагонизм, синергизм их действия и взаимозаменяемость. Так, там, где ионы K + , Mg 2+ , Mn 2+ , Ni 2+ выступают активаторами ферментов, ионы Na + , Ca 2+ , Zn 2+ , Cu соответственно – ингибиторами. Изменения степени окисления элемента в процессе его обмена сопровождается резкой сменой его физиологической активности. т ак Cr 2+ стимулирует белковый, углеводный и жировой обмен в организме, а Cr 6+ блокирует окислительное фосфорилирование. Всасывание Fe 2+ происходит легче, чем Fe 3+ .

Минеральные вещества в организме, как и все другие вещества, постоянно обновляются, часть выводится в составе продукции (с 1 литром молока выводится 1 г Са, с одним яйцом весом 56 г выводится 2 г кальция и 0,12 г фосфора).

Для организма важно не только количество поступающих отдельных химических элементов, но и их соотношения (кальций и фосфор 2:1, натрий : калий : кальций 1:1:1,5). Нарушение поступления количества и соотношения отдельных элементов в кормах приведет к дисбалансу этих элементов в организме и проявится различными заболеваниями.

^ Цель занятия. Познакомиться с методами исследования минерального обмена. Изучить роль отдельных химических элементов в обмене веществ.

Материалы и оборудование. NaOH, 10 % раствор; мурексид, 1 % раствор; трилон Б, 0,005М раствор (1,84 г сухого вещества доведенного дистиллированной водой до 1 л); ТХУ, 10 % раствор; молибдат аммония (5г молибденово-кислого аммония доводят до 100 мл 5 н серной кислотой); 1% раствор аскорбиновой кислоты в 0,1 н растворе HCl; стандартные растворы фосфора: а) основной – 4,394 KH₂PO₄, высушенного до постоянного веса и доведенного дистиллированной водой до 1 л, в 1 мл такого раствора содержится 1 мг фосфора, б) рабочий – 1 мл основного стандартного раствора доводят до 50 мл, в 1 мл данного раствора содержится 0,02 мг фосфора; хлорид натрия, 0,4 % раствор; ализариновый красный, 1% раствор водный; HCl, 0,01 н раствор из фиксанала; сыворотка крови; колбочки, цилиндры, пробирки, центрифужные пробирки, стеклянные палочки, центрифуга, фотоэлектроколориметр.

^ Опыт 1. Комплексонометрический метод определения кальция в сыворотке крови. Кальций составляет почти треть всех минеральных веществ в организме. Около 97 % кальция сосредоточено в костной ткани в виде фосфатов и карбонатов, 1 % кальция находится в ионизированном состоянии.

Содержание кальция в сыворотке крови зависит от вида, возраста и физиологического состава животного и в норме составляет в среднем:

По материалам medznate.ru