техника определения группы крови с помощью цоликлонов

Техника определения группы крови с помощью цоликлонов

Цоликлоны анти-А и анти-В предназначены для определения групп крови человека системы АВО взамен стандартных изогем-агглютинирующих сывороток.

Определение групп крови системы АВО включает выявление антигенов А и В в эритроцитах стандартными антителами и выявление агглютининов в сыворотке или плазме исследуемой крови стандартными эритроцитами. Антигены А и В определяют с помощью цоликлонов анти-А и анти-В. У доноров обязательно определение не только антигенов в эритроцитах, но и агглютининов в сыворотке (плазме) с помощью стандартных эритроцитов.

Основные свойства цоликлональных сывороток.

Цоликлоны анти-А и анти-В являются продуктом гибридомных клеточных линий, полученных в результате слияния мышиных антителообразующих В-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Индивидуальные гибридомные линии продуцируют гомогенные антитела только одного класса иммуноглобулинов, которые полностью идентичны по структуре и биологической активности. Антитела, продуцируемые клетками одного клона (потомство одной клетки), являются моноклональными.

Культура клеток одной специфичности, происходящих из одного лимфоцита, образует клетки одного клона. Главное заключается в следующем: необходимо получить от одной клетки специфические антитела и наработать их в неограниченном количестве. Трудность заключается в преодолении двух задач: во-первых, нормальные клетки после нескольких делений погибают; во-вторых, только раковые клетки способны неограниченно размножаться. Для решения этих двух несовместимых проблем в 1975 году Г. Кёлер и К. Мильштейн создали клеточные гибриды, или гибридомы. Гибридомы — это слияние нормальных лимфоцитов в питательной среде с клетками миеломы. Лимфоциты в этой среде не погибают, а от миеломного партнера получают возможность бесконечно размножаться. Таким образом, гибридомный клан размножается, а в результате этого процесса образуются моноклональные антитела.
Лимфоциты, несущие агтлютиноген А, вырабатывают специфическое антитело анти-А; лимфоциты, несущие агтлютиноген В, вырабатывают специфическое антитело анти-В.

Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя различными гибридомами. Цоликлоны анти-А и анти-В представляют собой разведенную асцитную жидкость мышей-носителей соответствующей гибридомы, в которой содержатся специфические иммуноглобулины класса М (IgM), направленные против группоспецифических антигенов А или В человека.
Таким образом, цоликлоны не содержат антител иной специфичности и поэтому не вызывают неспецифической полиагглютинации эритроцитов.

Авидность, то есть время наступления реакции агглютинации и ее выраженность, у цоликлонов анти-А и анти-В выше, чем у изогемагглютинирующих АВО-сывороток, особенно в случае слабо выраженных антигенов эритроцитов.
Цоликлоны не являются клетками человеческих тканей, что исключает возможность инфекционного заражения.

Методика определения групп крови с помощью цоликлонов анти-А и анти-В

Определение групп крови системы АВО реагентами цоликлон производится в нативной крови, стабилизированной с помощью применяемых консервантов (глюгицир, цитроглюкофосфат, гепарин и др.); в крови, взятой из пальца; в крови, взятой без консерванта. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов.

Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при температуре от +15° до +25°С. Реагенты не должны храниться открытыми, так как при высыхании активность антител снижается. Не следует пользоваться реагентами, если в них имеются нерастворимые хлопья или помутнение. Для каждого реагента используют свою маркированную (анти-А или анти-В) пипетку. Определение группы крови системы АВО производится обычными методами на белой фарфоровой или любой другой планшетке со смачиваемой поверхностью.

Высокая активность и авидность реагентов цоликлон позволяет применять по одной серии реагентов анти-А и анти-В. На плоскость планшета или тарелку наносят цоликлоны анти-А и анти-В по две капли (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А или анти-В. Рядом с каплями антител наносят исследуемую кровь по одной маленькой капле, приблизительно в 10 раз меньше (0,01 мл). В случае определения группы крови, взятой из пальца или взятой без консерванта, необходимо брать большое количество эритроцитов, т. е. первые капли из пальца (без сильного выдавливания) или свободные эритроциты из осадка свернувшейся крови.

При определении группы крови антитела и кровь смешивают стеклянной палочкой или углом предметного стекла, которые промывают и досуха вытирают перед размешиванием каждой капли. Наблюдение за реакцией проводят при легком покачивании в течение не более 2,5 минуты. Положительный результат при определении группы крови проявляет себя агглютинацией (склеиванием) эритроцитов. При этом агглютинаты можно увидеть без каких-либо приспособлений в виде мелких красных агрегатов, быстро сливающихся и образующих крупные хлопья.
При отрицательной реакции определения группы крови капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агтлютинаты в ней не обнаруживаются. Агглютинация, обычно, определяется в течении первых 3—5 секунд. Несмотря на это, наблюдение за результатами необходимо вести не меньше 2,5 минуты из-за возможности более позднего наступления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.

Источник: meduniver.com

Определение группы крови и резус-фактора

Определение группы крови и резус-фактора делятся на два способа:

первичное определение группы крови и резус фактора (цоликлоны Анти-А, Анти-B и Анти-D)
вторичная диагностика группы крови и резус-фактора (стандартные сыворотки и перекрестный способ, определение фенотипа, т.е. антигенов C, c, E, e, C w , K, k)

Экспресс-диагностика (первичное определение группы крови и Rh-фактора) не учитывает антигены Келл, не говоря уже про другие системы верификации. Поэтому цоликлоны применяют только для первичного определения группы крови и резус-фактора и при экстренных показаниях трансфузии компонентов крови.

Подробнее о самой редкой группе крови в Мире можно найти здесь.

Определение группы крови и резус-фактора цоликлонами анти-А, анти-В и Анти-D по системе AB0 и системе Резус

Определение группы крови и резус-фактора цоликлонами анти-А , анти-В и Анти-D супер является наиболее современным и относительно простым методом. Для определения группы крови используются цоликлоны, т.е. моноклональные антитела.

Что требуется для определения группы крови и резус-фактора?

– цоликлон анти-А ;

– цоликлон анти-В ;

– цоликлон анти-D ;

– раствор натрия хлорида 0,9 %; специальный планшет; стерильные палочки.

Алгоритм и порядок определения группы крови

Нанести цоликлоны анти-А , анти-В на специальный планшет по одной большой капле (0,1 мл), под соответствующими надписями.

Рядом с ними капнуть исследуемую кровь (0,01–0,03 мл) по одной маленькой капле. Перемешать их и наблюдать за наступлением или отсутствием реакции агглютинации в течение 3 мин. При сомнительном результате добавить 1 каплю 0,9% физиологического раствора.

Расшифровка результатов определения группы крови

если реакция агглютинации наступила с анти-А цоликлоном , то исследуемая кровь относится к группе А (II);
если реакция агглютинации наступила с анти-B цоликлоном , то исследуемая кровь относится к группе B (III);
если реакция агглютинации не наступила с анти-А и с анти-B цоликлонами, то исследуемая кровь относится к группе 0 (I);
если реакция агглютинации наступила с анти-А и с анти-B цоликлонами, то исследуемая кровь относится к группе AB (IV), как показано на рисунке.

Определение резус-фактора цоликлоном Анти- D

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D цоликлона и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови пациента. За наступлением реакции агглютинации или её отсутствием наблюдают в течение 3 мин.

если реакция агглютинации наступила с цоликлоном анти-D , то исследуемая кровь относится к резус-положительной (Rh + )
если реакция агглютинации не наступила с цоликлоном анти-D , то исследуемая кровь относится к резус-отрицательной (Rh — )

Другими словами, при смешивании цоликлона Анти-D с резус-положительными эритроцитами наступает реакция агглютинации, а если кровь резус-отрицательная — агглютинация отсутствует (как показано на рисунке — четвертая группа крови резус-отрицательная).

Определение групп крови стандартными сыворотками

Определение групп крови стандартными изогемагглютинирующими сыворотками — поиск и обнаружение в крови антигенов А и В с помощью реакции агглютинации. Для достижения цели используют:

Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп крови О (I) — бесцветная, А (II) — синяя, В (III) — красная, АВ (IV) — жёлтая.
Белые тарелки, маркированные группами крови: 0 (I), А (II), В (III), AB (IV).
NaCl 0,9%
Стеклянные палочки

Методика определение группы крови стандартными сыворотками

Подписать тарелку (Ф.И.О. пациента);
Нанести обозначения двух серий стандартных сывороток I, II и III групп крови в объёме 0,1 мл, образующие два ряда по три капли слева направо: 0 (I), А (II), В (III);
Забрать кровь из вены. Шесть капель исследуемой крови пациента перенести стеклянной палочкой на пластину в шесть точек рядом с каплей стандартной сыворотки и перемешать.

Агглютинация начнется через 30 сек. В те капли, где произошла агглютинация, добавить по одной капле NaCl 0,9% и оценить результат.

Оценка результатов определение группы крови стандартными сыворотками

Положительная реакция агглютинации может быть пескообразной или лепестковой. При отрицательной реакции капля остаётся равномерно окрашенной в красный цвет. Результаты реакций в каплях с сыворотками одной и той же группы (двух серий) должны совпадать. Принадлежность исследуемой крови к соответствующей группе определяют по наличию или отсутствию агглютинации при реакции с соответствующими сыворотками после наблюдения в течение 5 мин. При этом следует отметить, что если сыворотки всех трёх групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что испытуемая кровь содержит оба агглютиногена (А и В) и принадлежит к группе AB (IV). Однако в таких случаях для исключения неспецифической реакции агглютинации необходимо провести дополнительное контрольное исследование испытуемой крови со стандартной изогемагглютинирующей сывороткой группы AB (IV), не содержащей агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле при наличии агглютинации в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп 0 (I), А (II) и В (III), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ (IV).

Определение группы крови перекрёстным способом

Определение группы крови перекрестным способом — обнаружение наличия или отсутствия в исследуемой крови антигенов А и В с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток, а также антител α и β с помощью стандартных эритроцитов. Реакцию со стандартными сыворотками проводят описанным выше способом.

Методика определения группы крови перекрестным способом

Реакция со стандартными эритроцитами

Для реакции со стандартными эритроцитами необходимы стандартные эритроциты трёх групп крови: 0 (I), А (II), B (III).

Методика проведения реакции со стандартными эритроцитами

Кровь для исследования берут из вены в пробирку, центрифугируют или оставляют на 30 мин для получения сыворотки.
На маркированную тарелку наносят три больших капли (0,1 мл) сыворотки крови из пробирки, а рядом с ними по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп.
Соответствующие капли смешивают стеклянными палочками, планшет покачивают, наблюдают в течение 5 мин, в капли с агглютинацией добавляют NaCl 0,9% и оценивают результат.

Оценка результатов проведения реакции со стандартными эритроцитами

Оценивают результаты, полученные со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и стандартными эритроцитами. Особенность результатов реакции со стандартными эритроцитами — эритроциты группы 0 (I) считают контрольными. Результат перекрёстного способа считают достоверным, если при реакции со стандартными изогемагглютинирующими сыворотками и со стандартными эритроцитами ответы о группе исследуемой крови совпадают. Если этого не происходит, обе реакции следует переделать.

Источник: anest-rean.ru

Определение группы крови и резус-фактора с помощью цоликлонов

Цоликлоны – это моноклинальные антитела, полученные путем генной инженерии из крови стерильных мышей и применяемые для определения группы крови системы АВО. В отличие от стандартных сывороток, цоликлоны отличаются очень высокой активностью и авидностью, то есть временем наступления и выраженностью реакции агглютинации (склеивания). Основными цоликлонами являются: анти-A, анти-B, анти-AB, анти-0 и другие. По ним определяют группы крови и резус-фактор.

Определение группы крови данным методом проводится в лаборатории. Температура воздуха в помещении должна составлять от +15 до + 25 градусов C. Исследование должно проходить при хорошем освещении. Все реагенты нужно хранить плотно закрытыми, поскольку при высыхании активность антител значительно снижается. Нельзя использовать мутные и содержащие хлопья реагенты. Для каждого из них нужна отдельная пипетка. Процедура проводится на планшете или тарелке белого цвета, поверхность которых должна хорошо смачиваться. Благодаря высокой авидности и активности цоликлонов, есть возможность применения по одной серии анти-A и анти-B реагентов.

На планшете делают надписи: анти-A и анти-B. Под соответствующие надписи капают цоликлоны в количестве примерно 0,1 мл. Реагент анти-A имеет желтовато-розовый цвет, анти-B – синий. Рядом с моноклональными антителами капают по капле крови и смешивают ее с реагентами стеклянной палочкой или уголком предметного стекла. Перед смешиванием следующей пары капель палочку или стекло тщательно промывают и вытирают насухо.

На протяжении 2,5 минут ведут наблюдение за агглютинацией, при этом планшет слегка покачивают. Затем оценивают результат. Надо сказать, что для наблюдения за процессом не требуются никакие приспособления. Агглютинаты хорошо видны невооруженным глазом, они быстро сливаются и образуют большие хлопья. Если склеивания не происходит, капля реагента равномерно окрашивается в красный цвет.

Если агглютинация отсутствует (и с цоликлоном анти-A, и с анти-B), в эритроцитах нет ни антигена A, ни B. Это I группа.
Если агглютинация есть лишь с цоликлоном анти-A, в эритроцитах содержится только антиген A. Это кровь II группы.
Если агглютинация наблюдается лишь с цоликлоном анти-B, в красных клетках есть только антиген B. Это III группа.
Если агглютинация произошла c цоликлоном и анти-A, и анти-B, в эритроцитах есть оба антигена. Для исключения аутоагглютинации проводят контрольную процедуру: смешивают изотонический раствор натрия хлорида (0,1 мл) и исследуемую кровь (0,01 мл). Если агглютинация отсутствует, то это IV группа.

На планшет наносят большую каплю реагента анти-D-супер. Рядом – маленькую (в 10 раз меньше) исследуемой крови, которую смешивают с реагентом и оценивают результат. Если началась агглютинация, кровь является резус-положительной, при отрицательном резус-факторе агглютинации не происходит.

Моноклональные реагенты для определения группы крови имеют явные преимущества по сравнению со стандартными изогем-агглютинирующими сыворотками. Они обеспечивают очень точный результат, а сама процедура безболезненна, безопасна и занимает очень мало времени.

Источник: serdec.ru