Принцип метода: В качестве субстрата для a-амилазы используется мальтотриозид, связанный с хромогеном 2-хлор-п-нитрофенолом. Под действием a-амилазы субстрат гидролизуется с выделением окрашенного 2-хлор-п-нитрофенола, мальтотриозы и глюкозы. Реакция протекает быстро и не требует присутствия в реакционной смеси коферментов. Скорость гидролиза субстрата прямо пропорциональна активности a-амилазы в пробе и изеряется спектрофотометрически при длине волны 405 нм.
Субстрат-ХНФ ————> ХНФ + глюкоза + Мальтотриоза
Линейность метода: до 1500 Е/л.
a-Амилаза в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25°С) в течение 7 дней, при температуре хранения 2-8°С в течение 2 месяцев.
1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 405 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37°С;
3) Автоматические пипетки на 25 мкл и 1000 мкл;
В качестве источника фермента можно использовать и слюнную жидкость (слюну предварительно разбавить дистиллированной водой в 100 раз), но диапазон нормы при этом варьирует в значительной степени.
6) Рабочий реагент (субстрат – 1,8 ммоль/л в МЕS-буфере (рН 6,0±0,1)).
Рабочий реагент годен для применения, если его оптическая плотность не выше 0,6 ед.опт.плотн. при длине волны 405 нм и нет мутности.
Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37°С).
Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 405 нм ровно через 1 мин. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту, а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (Dо.п./мин).
Расчет активности a-амилазы по фактору проводят по формуле:
где Dо.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;
1,025 – общий объем раствора в кювете;
1000 – коэффициент перевода мл в л;
12,9 – коэффициент миллимолярного поглощения 2-хлор-п-нитрофенола;
0,025 – объем сыворотки в мл;
1,0 – длина оптического пути.
При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать. Если активность a-амилазы превышает 1500 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: a-Амилаза – это эндогидролаза и в организме человека представлена несколькими изоферментами: фермент секретируется слюнными железами (S-тип), поджелудочной железой (Р-тип); небольшая активность фермента обнаружена в печени, скелетных мышцах, слезной жидкости, секрете молочных желез и различных опухолях.
Активность a-амилазы в сыворотке значительно возрастает за счет Р-изофермента при различных заболеваниях поджелудочной железы (панкреатит, абсцесс, травма, рак).
При повреждениях слюнных желез (рак слюнных желез, эндемический паротит, макроамилаземия) активность a-амилазы в сыворотке также увеличивается, но за счет S-изофермента.
Оба изофермента a-амилазы имеют небольшую молекулярную массу (45 000), поэтому фильтруются в почках и экскретируются с мочой. Повышение активности амилазы мочи (диастаза) при остром панкреатите наступает на 6-10 часов позднее, чем в сыворотке крови.
По материалам biohimist.ru
Работа № 4. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче. — раздел Химия, БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Принцип Метода. Альфа-Амилаза Катализирует Гидролиз Нераство.
Принцип метода. Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.
Ход определения. Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности:
Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.
Активность фермента находят по калибровочному графику.
Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче:у человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (»48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.
У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче — от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.
Эта тема принадлежит разделу:
высшего профессионального образования. Башкирский государственный медицинский университет. Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Если Вам нужно дополнительный материал на эту тему, или Вы не нашли то, что искали, рекомендуем воспользоваться поиском по нашей базе работ: Работа № 4. Определение активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче.
Если этот материал оказался полезным ля Вас, Вы можете сохранить его на свою страничку в социальных сетях:
Рекомендуемые темы реферативных сообщений
1. Протеомика – новое направление в биохимии и молекулярной биологии. Протеом человека. 2. Методы установления первичной структуры белков. 3. Современные методы количественного оп
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к занятию повторите раздел из курса биоорганической химии «Структура и свойства аминокислот». Используя лекции и учебник по биохимии, изучите химический состав, строение, уровни орга
Аминокислоты, придающие белкам основный характер —
а) цистеин и метионин б) аргинин и лизин в) триптофан и фенилаланин г) лейцин и изолейцин д) глицин и аланин 1.3. Атомы остова полипепти
Работа № 1. Количественное определение белка сыворотки крови биуретовым методом.
Клинико-диагностическое значение.Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическому свойству. Нормальное содержание белка
Построение калибровочного графика.
Для этого применяют стандартный белок – альбумин сыворотки крови. Из 10% стандартного раствора альбумина в 4 пробирках готовят растворы белка как показано в таблице.
Фотоэлектроколориметр
Для измерения оптической плотности или светопропускания жидких растворов по отношению к растворителю или стандартному раствору предназначен фотоэлектрический колориметр (ФЭК). В основу раб
УИРС. Исследование некоторых особенностей аминокислотного состава яичного, соевого белков и желатина.
Для изучения аминокислотного состава белков можно использовать специфические качественные реакции, основанные на особенностях строения бокового радикала аминокислот. Проделайте качественные реакции
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к занятию следует повторить структуры белка, вспомнить типы связей, стабилизирующие первичную, вторичную и третичную структуры белков. Необходимо изучить обратимые и необратимые мето
Работа № 1. Высаливание белков сыворотки крови сернокислым аммонием.
Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Высаливание белков сернокислым аммонием может быть использовано для разделения
Работа № 2. Осаждение белков при кипячении.
При нагревании почти все белки денатурируют и выпадают в осадок. При этом разрушаются водородные связи, происходит изменение вторичной и третичной структуры белка, белок теряет глобулярную форму и
Брандберга-Робертса-Стольникова.
Клинико-диагностическое значение.В норме моча не содержит белка в количестве, обнаруживаемом обычными химическими методами. Белок в моче появляется при заболеваниях почек, при нару
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Аминокислотный состав пептида отличается высоким содержанием диаминомонокарбоновых кислот – лизина и аргинина, в то же время, в структуре пептида отсутствуют ароматические
Методические указания к самоподготовке
Методы препаративной химии белков основаны на их физико-химических свойствах, поэтому при подготовке к занятию следует повторить физико-химические свойства белков. Особое внимание следует уделить к
Фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге.
Принцип метода. Электрофорез – это движение заряженных частиц в поле постоянного электрического тока. Скорость перемещения молекул белков в электрическом поле зависит от величин за
Порядок выполнения работы
1. Устройство прибора для электрофореза. Прибор состоит из выпрямителя, подающего постоянный ток необходимого напряжения, и камеры для электрофореза. Сама камера состоит из 2-х ван
Работа № 2. Очистка белков от низкомолекулярных примесей методом диализа.
Принцип методаоснован на неспособности молекул белка (коллоидных частиц) проникать через полупроницаемую мембрану (пергамент, целлофан, колодий и др.), в то время как низкомолекуля
Работа № 3. Очистка от низкомолекулярных примесей методом гельфильтрации на сефадексе (молселекте).
Основным свойством декстранового геля, как хроматографического материала, является способность разделять вещества согласно размерам молекул. Крупные молекулы при хроматографии не проникают в частиц
Методические указания к самоподготовке
Для успешного овладения материала по сложным белкам необходимо иметь четкие представления о структуре их простетической группы, поэтому при подготовке к занятию необходимо вспомнить строение углево
Работа № 2. Выделение муцина слюны и определение в нем углеводного компонента.
Углевод в муцине можно обнаружить с помощью реакции Молиша. Реакция основана на дегидратации гексоз и пентоз с образованием оксиметилфурфурола и фурфурола при действии концентрированной серной кисл
Работа № 4. Гидролиз казеина и открытие в гидролизате фосфорной кислоты.
Ход работы. 100 мг порошка казеина растворяют в пробирке в 3 мл 10% раствора едкого натра или кали. Пробирку закрывают пробкой со стеклянной трубкой в качестве холодильника, закреп
Работа № 5. Определение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в сыворотке крови турбидиметрическим методом.
Клинико-диагностическое значение.Содержание ЛПНП (b-липопротеинов) в крови колеблется в зависимости от возраста, пола и составляет в норме 3-4,5 г/л. Увеличение концентрации ЛПНП н
Работа № 2. Специфичность ферментов.
Одно из более характерных свойств ферментов — их высокая специфичность. Ферменты специфичны как в отношении типа катализируемых реакций, так и в отношении субстратов, на которые они воздействуют. Б
Порядок выполнения работы
В чистую пробирку отливают небольшое количество разведенной слюны (2-3мл) и кипятят ее в течение 5-8 минут, после чего охлаждают В 3 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахм
Влияние рН среды на активность амилазы
№ п/п Кол-во 0,2 м р-ра Na2HPO4, мл Кол-во р-ра лимонной к-ты, мл рН смеси Кол-во 0,5% р-ра к
Методические указания к самоподготовке
Для усвоения темы выполните задания, представленные в таблице. №№ Задание Указания к выполнению задания
Амилазы ротовой жидкости.
Целью данной работы является установление актвирующего и ингибирующего влияния различных ионов на каталитическую активность ферментов. Так, например, ионы натрия и хлора стимулируют активность амил
Малоновой кислотой.
Принцип метода основан на изменении окраски метиленовой сини при восстановлении его в ходе окислительно-восстановительной реакции. При дегидрировании янтарной кислоты сукцинатдегид
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.График Лайнуивера-Берка – график двойных обратных величин (1/V против 1/S).
Методические указания к самоподготовке
Для усвоения темы выполните следующие задания. №№ Задание Указания к выполнению задания
Ферменты, наиболее широко используемые в диагностике
фермент Заболевания, при которых активность фермента повышается в крови АлАТ (аланинаминотрансфераза) АсАТ (аспартатаминотрансфе
Основы иммуноферментного анализа
Сущность ИФА, относящегося к иммунохимическим методам, заключается в специфическом взаимодействии антигена и антитела с последующим присоединением к образующемуся комплексу коньюгата – анти-антител
По Вольгемуту.
Амилаза — фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы (химизм реакции см. занятие№6). Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йод
Работа № 2. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку.
Принцип метода. Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови. Пируват с 2,4- динитрофенилгидразином (2,
УИРС. Исследование амилазной активности мочи.
Исследование амилазной активности мочи по Вольгемуту производится аналогично методике приведенной выше для определения активности амилазы слюны). Амилазная активность мочи также отражает и величину
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Молярная активность (число оборотов) – это количество молекул субстрата, превращаемое одной молекулой фермента за единицу времени. Молярная активность выражается в единица
Рекомендуемые темы реферативных сообщений
1.Ферменты желудочного сока в норме и патологии. 2.Ферменты поджелудочного сока, роль в норме и патологии. 3. Гормональная регуляция функций желудка. 4. Диагностическое з
План занятия
1. Контроль выполнения задания по самоподготовке, ответы на тесты. 2.Рассмотрение узловых вопросов, решение ситуационных задач, заслушивание и обсуждение реферативных сообщений. 3
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Фонд свободных аминокислот организма наполняется из трех источников- белков пищи, Белков собственных тканей и за счет синтеза из углеводов. Последний пункт справедлив толь
Основные характеристики пищеварительных соков
Показатели Слюна Желудочный сок Панкреатический сок Желчь Сок тонкого кишечника
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к данному занятию проштудируйте по учебнику и лекциям материал по истории открытия и изучения витаминов, их номенклатуре, классификации, нарушениям баланса витаминов. При изучении о
Реакция с раствором уксусно-кислой меди.
К 1 мл 0,1% раствора никотиновой кислоты добавить 1 мл 10% раствора бикарбоната натрия, прилить равный объем 5% раствора уксусно-кислой меди.
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Препараты витамина К используются как средства, предупреждающие кровотечения, поскольку витамин К относится к непрямым коагулянтам, участвующим в образовании в печени факт
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к данному занятию необходимо вспомнить материал модуля «Ферменты» — иметь четкие представления о строении активного центра ферментов-протеидов. При изучении отдельных витаминов особ
В. Определение витамина C в лекарственных растениях.
Техника выполнения работы.На аптечных весах берут навески лекарственного сырья (листья крапивы, цветы тысячелистника и др.) по 0,5 г, шиповник, очищенный от семян – 0,2 г. Исследуе
Работа № 2. Количественное определение витамина Р в чае по Левенталю.
В основе метода лежит способность рутина окисляться перманганатом калия. В качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом калия после того, как окислится в
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Коферментная форма витамина Вс – тетрагидрофолиевая кислота (ТГФК) играет роль переносчика одноуглеродных групп (метильного, формильного радикалов) при биосинтезе тимина,
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к занятию, пользуясь учебниками и лекциями по биологической химии, выполните задания: №№ Задание Указания к выполнению за
Работа № 1. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче.
Принцип метода. Пировиноградная кислота является одним из промежуточных продуктов углеводного обмена. Пировиноградная кислота взаимодействует с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочно
Работа № 2. Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц.
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) окисляет янтарную кислоту в фумаровую. Коферментом СДГ является флавинадениндинуклеотид. В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используе
Работа № 3. Определение активности пероксидазы в растительном материале по методу А. Н. Бояркина.
Принцип метода.Метод основан на непрерывном измерении светопоглощения бензидиновой сини, образующейся при окислении бензидина под действием пероксидазы. Реакция описываетс
Работа № 5. Обнаружение активности цитохромоксидазы.
При добавлении к срезам тканей α-нафтола и парафенилендиамина происходит окрашивание тканей вследствие образования индофеноловой сини. Эта реакция катализируется цитохромоксидазой. Хи
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Энергия гидролиза АТФ составляет – 7,3 ккал/моль, следовательно, гидролиз 12,5 молекул АТФ высвобождает 12,5 ´ 7,3 = 91,3 ккал/моль энергии, тогда как образование эт
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к семинару обобщите свои представления об обмене веществ и энергии в организме. Обратите внимание на единство структуры и функции митохондрий, на высокую специализацию различных окси
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Окисление сукцината до оксалоацетата сопровождается восстановлением одной молекулы ФАД и одной молекулы НАД. Последующее окисление ФАДН2 в дыхательной цепи сопр
Рекомендуемые темы реферативных сообщений
1. Нарушения переваривания и всасывания углеводов. 2. Неперевариваемые углеводы и их роль в питании (основной компонент пищевых волокон). 3. Механизмы трансмембранного переноса мо
Методические указания к самоподготовке
Материал, изучаемый на данном практическом занятии чрезвычайно важен и имеет большое значение как для исследователей, так и для практических врачей; его освоение необходимо для понимания последующи
Работа № 1. Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови глюкозооксидазным методом.
Принцип метода.Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием пероксида водорода, при разрушении которого под влиянием пероксидазы прои
Работа № 2. Определение глюкозы в крови по цветной реакции с орто-толуидином.
Принцип метода. Белки крови осаждаются трихлоруксусной кислотой и отделяются центрифугированием. Центрифугат обрабатывается орто-толуидиновым реактивом. Глюкоза при нагрев
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1. Подобную картину заболевания вызывает недостаточность лактазы (b-1,4-гликозидазы), которая катализирует гидролиз дисахарида лактозы, содержащегося в молоке, на глюкозу и
Методические указания к самоподготовке
Материал, рассматриваемый на данном семинарском занятии чрезвычайно важен, поскольку большинство заболеваний общего или местного характера протекает с дисбалансом обмена углеводов. Окисление углево
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Ставить диагноз «сахарный диабет» только на основании результата проведенного исследования нельзя. Содержание глюкозы в крови может повыситься и как следствие стресс-реакц
Рекомендуемые темы реферативных сообщений
1. Эссенциальные (незаменимые) факторы питания липидной природы. 2. Нарушения переваривания и всасывания липидов. 3. Гормональная регуляция синтеза и мобилизации жиров. 4
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к данному занятию нужно восстановить в памяти материал, касающийся химии липидов, их классификации (лекции, соответствующие разделы учебника). При рассмотрении вопросов обмена липидо
Работа № 1. Количественное определение активности липазы в панкреатическом соке.
Работа позволяет качественно обнаружить наличие липазы в панкреатическом соке и дать количественную оценку ее действия. Принцип метода. Метод основан на нейтрализации щело
Работа № 2. Количественное определение триацилглицеринов в сыворотке крови.
Принцип метода. Триацилглицерины (ТАГ) омыляются гидроксидом калия с образованием глицерина, при окислении которого образуется формальдегид. Реактив, содержащий ацетилацетон, взаим
Работа № 3. Реакция на кетоновые тела (ацетон).
Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия оранжево-красное окрашивание (проба Легаля). СН3-С-СН3+Na2
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1. Спортсмен перед стартом находится в состоянии стресса, характеризующегося активацией симпато-адреналовой системы. Увеличение уровня адреналина активирует через аденилатци
Методические указания к самоподготовке
Знание строения, обмена и функций простых и сложных липидов, холестерина необходимо для понимания принципов построения и функционирования биологических мембран, биохимических основ развития ряда за
Работа № 1. Количественное определение холестерина в сыворотке крови по методу Илька.
Принцип метода. Холестерин, содержащийся в сыворотке крови, обрабатывается реактивом Либермана-Бурхарда (смесь уксусного ангидрида, ледяной уксусной кислоты и концентрированной Н
Работа № 3. Определение холестерина в ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП. Расчет атерогенности.
Принцип метода.Способ основан на определении концентрации общего холестерина в пробах сыворотки крови до осаждения атерогенных апо-В-содержащих липопротеинов (ЛПОНП, ЛПНП и их «рем
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1. Выделение холестерина в желчь должно сопровождаться пропорциональным выделением желчных кислот и фосфолипидов, удерживающих гидрофобные молекулы холестерина в растворенно
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к занятию, используя лекции, учебники и дополнительную литературу, выполните следующие задания: №№ Задание
Работа № 1. Количественное определение протеолитической активности желудочного сока по Ансену.
Принцип метода.О протеолитической активности желудочного сока судят по количеству образующихся при расщеплении казеина неосаждаемых ТХУ пептидов, концентрация которых соответствует
Работа №2. Определение активности уропепсина.
Метод основан на способности пепсина в определенных условиях расщеплять белковую молекулу гемоглобина с освобождением тирозина и триптофана. По концентрации последних судят о пептической активности
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к занятию, используя лекции, учебники и дополнительную литературу, выполните следующие задания: №№ Задание
Работа № 1. Колориметрический метод определения активности аспартат- и аланинаминотрансфераз в сыворотке крови.
Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение для диагностики болезней печени. Для острого гепатита характерно раннее повышение активности аланинаминотрансферазы (А
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к занятию, используя лекции, учебники и дополнительную литературу, выполните следующие задания: №№ Задание
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1. Замена не отразится на составе пептида, так как оба триплета ГЦУ и ГЦЦ кодируют одну и ту же аминокислоту аланин. Задача 2. Прис
Методические указания к самоподготовке
При подготовке к занятию, используя лекции, учебники и дополнительную литературу, выполните следующие задания: №/№ Задание Указания к вы
Техника выполнения работы.
В центрифужные пробирки вносят 1 мл сыворотки крови, добавляют 8 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 0,35М серной кислоты, перемешивают. Затем добавляют 0,5 мл 10% раствора вольфрамата натрия, опять п
В моче.
В норме у человека с мочой выделяется 3,54-4,76 ммоль/сут (600-800 мг/сут) мочевой кислоты. У мужчин несколько больше, чем у женщин. Увеличение выведения солей мочевой кислоты наблюдается при подаг
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1. Уровень мочевой кислоты выше нормы – гиперурикемия. Наиболее вероятная причина – подагра. Рекомендуется ограничить употребление мяса и рыбы – источника пуринов. При болях
Рекомендуемые темы реферативных сообщений
1. История развития учения о гормонах. Лауреаты Нобелевских премий. 2. Гипоталамус – узел перекреста нервно-рефлекторных и гуморальных механизмов регуляции обмена веществ. 3. Горм
Методические указания к самоподготовке
Для понимания и освоения интеграции обмена веществ и взаимопревращении углеводов, липидов и аминокислот необходимо вспомнить магистральные пути превращений белков, аминокислот, липидов и углеводов,
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.При голодании активируется процесс глюконеогенеза а печени и корковом слое почек, что позволяет поддерживать урове
Современные методы определения количества гормонов
До 60-х годов прошлого столетия об активности большинства гормонов, особенно белково-пептидной природы судили путем использования биологических методов – по выраженности того или иного эффекта посл
Работа № 1. Качественные реакции на инсулин.
Инсулин является типичным гормоном белковой природы, содержащий сульфгидрильные группы цистеина, и дает цветную биуретовую реакцию на белок и реакцию Фоля на содержание SH-групп. Для реакций исполь
Работа № 4. Количественное определение адреналина (по Фолину).
Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении интенсивности синего окрашивания, которое образуется при взаимодействии адреналина с реактивом Фолина. Реакт
Методические указания к самоподготовке
Материал данной темы важен для понимания адаптивных реакций организма на различные стрессорные ситуации (боль, травма, болезнь, голод, физические напряжения и др.), для усвоения гендерных различий
Работа № 3. Количественное определение 17-кетостероидов в моче.
Количество 17-кетостероидов в моче у здорового человека составляет у мужчин 7-23мг/сутки и 6-18мг/сутки у женщин. Различные состояния напряжения (стресс) характеризуются повышением их экскреции до
Рекомендуемые темы реферативных сообщений
1. Биохимические основы адгезии и агрегации тромбоцитов. 2. Молекулярные механизмы противосвертывающего действия аспирина. 3. Система гепарин – антитромбины, их физиологическая ро
Методические указания к самоподготовке
Материал, изучаемый на данном практическом занятии, чрезвычайно важен для как для исследователей, так и для практических врачей. Фундаментальная роль крови, состоящая в поддержании гомеостаза, а та
Работа № 1. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека.
Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивност
Работа № 2. Определение щелочного резерва крови титрометрическим методом
Резервная щелочность крови – это количество оснований крови, связанных с углекислотой. По данной методике определяется запас щелочных валентностей в цельной крови, включая и эритроциты.
Работа № 3. Определение времени свертывания крови (метод Мас и Магро)
Ход работы. На часовое стекло, покрытое тонким слоем парафина, налить большую каплю вазелинового масла. Произвести укол в мякоть пальца, набрать каплю крови в капиллярную пипетку С
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1. Появление в плазме крови «патологических белков» называют парапротеинемией, с ней часто связано увеличение общего содержания белков до 100-160 г/л. Так, у больных миеломн
Методические указания к самоподготовке
Материал, изучаемый на данном практическом занятии, чрезвычайно важен, поскольку печень играет важную роль в пищеварении, в обмене веществ, синтезе и выделении из организма токсических продуктов об
Работа № 1. Пробы коллоидоустойчивости белков сыворотки крови.
А. Тимоловая проба Принцип метода.Метод основан на образовании плохо растворимого глобулино-тимололипидного комплекса при взаимодействии сыворотки крови с тимоло-ве
Работа № 2. Количественное определение активности альдолазы в сыворотке крови (метод Брунса в модификации Е.Н. Валуйской и В.И. Товарницкого).
Принцип метода. Альдолаза расщепляет фруктозо-1,6-дифосфат, продукты расщепления которого образуют с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде соединения, окрашенное в малиной цв
Работа № 3. Определение активности фруктозо-1-фосфаталь-долазы.
Принцип методаоснован на связывании фосфотриоз, образующихся после расщепления ферментом фруктозо-1-фосфата, гидразином, с последующим определением триоз, освобождающихся при щелоч
Работа №4. Количественное определение активности каталазы крови методом А.Н. Баха и С.Р. Зубковой.
Принцип метода.Метод основан на титровании избытка перекиси водорода, нерасщепленного каталазой, перманганатом калия в кислой среде. 5Н2О2 + 2КМnО
Работа № 5. Количественное определение активности пероксидазы крови по методу Н.И. Симаковой.
Принцип метода.Метод основан на окислении индигокармина кислородом, выделяющемся при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазы. Активность фермента измеряется временем,
Методические указания к самоподготовке
Материал, изучаемый на данном практическом занятии, чрезвычайно важен для как для исследователей, так и для практических врачей. Знание особенностей химического состава и метаболизма мышечной ткани
Работа № 1. Выделение гликогена из мышечной ткани.
Принцип метода.При экстракции используется способность гликогена к растворению в кислой среде. Применение трихлоруксусной или хлорной кислот в качестве экстрагирующего агента однов
Работа №3. Количественное определение креатинина в моче по Яффе.
Принцип метода.Метод основан на способности креатинина в щелочной среде взаимодействовать с пикриновой кислотой с образованием пикрата креатинина оранжево-красного цвета.
Работа № 5. Тонкослойная хроматография липидов ткани мозга.
Для исследования взять 250 мг ткани мозга, смешать с 5 – 10 мл свежеприготовленной смеси хлороформа и метанола (2:1), поместить в мерную колбу с притертой крышкой на 25 мл и энергично встряхивать с
Работа № 6. Определение активности холинэстеразы в головном мозге.
В ткани мозга содержатся специфическая и неспецифическая холинэстеразы. Специфическая – гидролизует ацетилхолин, неспецифическая – помимо ацетилхолина гидролизует бутирил- и бензоилхолины.
Методические указания к самоподготовке
Материал, изучаемый на данном занятии, чрезвычайно важен для правильной ориентировки в вопросах нормы и патологии соединительной ткани, тканей кости и зуба, а также для последующего усвоения вопрос
Работа № 2. Количественное определение свободного оксипролина в моче.
Принцип метода.Метод основан на окислении гидроксипролина пероксидом водорода в присутствии ионов меди (II) в щелочной среде до пиррола. Пиррол образует розовое окрашивание с парад
Работа № 3. Количественное определение гликозаминогликанов в коже.
О количестве гликозаминогликанов в тканях судят по содержанию одного из компонентов – гексуроновых (глюкуроновой и идуроновой) кислот, выделяемых кислотным гидролизом. Продукты гидратации гексуроно
Работа № 4. Исследование минерального состава тканей кости и зуба.
А) Растворение солей костной ткани. Навеску кости перенести в колбу, прилить 10 мл 2 н раствора соляной кислоты, закрыть пробкой с обратным холодильником, поместить на сетку
Методические указания к самоподготовке
Знание роли почек в поддержании гомеостаза необходимо для понимания механизмов возникновения патологических отклонений в метаболизме почек и изменений биохимических параметров мочи. Изучение физико
Работа № 1. Определение показателей физико-химических свойств мочи.
Определение цвета мочи Нормальная свежевыделенная моча представляет собой прозрачную жидкость соломенно-желтого цвета. Нормальная окраска мочи обусловлена наличием в ней ряда пигмен
Работа № 2. Определение химических компонентов нормальной мочи.
Качественное определение хлоридов Налить в пробирку 1 мл мочи, добавить 2 — 3 капли 30% раствора азотной кислоты и 3 — 4 капли 1% раствора азотнокислого серебра. Образуется творожис
Качественное определение белка.
Белок мочи состоит из сывороточного альбумина и глобулинов. Кроме того, на белок дает реакцию моча, содержащая кровь и гной. Белок в моче обнаруживается с помощью реакций осаждения. В норм
Качественное определение сахара в моче с помощью реактива Фелинга.
В норме в моче содержится 0,2-0,4 г/л глюкозы и она не обнаруживается обычными реакциями. При диабете и некоторых других заболеваниях, а также после обильного приема с пищей углеводов, эмоционально
Количественное определение белка в моче по методу Робертса-Стольникова.
При наличии в моче белка, открытого качественными реакциями, его количество определяют методом Робертса-Стольникова. В основе метода лежит проба Геллера – денатурация белка азотной кислотой. Экспер
Качественное определение кетоновых тел.
В нормальной моче кетоновые тела (ацетон, ацетоуксусная и b-гидроксимасляная кислоты) содержатся в небольших количествах (0,02-0,05 г/сут, или 20-50 мг) и обычными качественными реакциями не обнару
Качественная реакция на кровяные пигменты.
Появление в моче форменных элементов крови (гематурия) или кровяных пигментов (гемоглобинурия) относится к патологии и может быть обнаружено с помощью ряда проб (гваяковой, бензидиновой и др.). Гем
Эталоны ответов на ситуационные задачи
Задача 1.Юкстагломерулярный аппарат петли Генли контролирует концентрацию ионов натрия в почечной ткани и побуждает синтез ренина при снижении концентрации ионов натрия. Ренин, в с
Журналы по биохимии
1. Биохимия: Ежемесячный журн. // РАН. – Основан А.Н.Бахом в 1936 г.-М.: Наука, 1938 – 2008. 2. Биомедицинская химия: Науч.- практ. журнал РАМН. – Основан в 1956 г. – 6 номеров в год.- М.:
Жидких сред организма
Показатели крови: Белок, общий (в сыворотке крови) 60 – 85 г/л Альбумин (в сыворотке крови) 35-50
Жидких сред организма у детей
Показатели крови: Белок, общий (в сыворотке крови) до 1 года ≥ 1 года 46-76 г/л 60-80 г/л
По материалам allrefs.net
Принцип метода. Альфа-амилаза катализирует гидролиз нерастворимого цветного крахмального субстрата с образованием синего растворимого в воде красителя. Количество освобожденного красителя пропорционально активности фермента.
Ход определения. Для определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови или моче готовят параллельно опытную и контрольную пробы и анализируют в следующей последовательности:
Пробы перемешивают, оставляют стоять на 15 мин, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Затем измеряют оптическую плотность опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 590 нм в кюветах с толщиной слоя 5,0 мм.
Активность фермента находят по калибровочному графику.
Клинико-диагностическое значение определения активности альфа-амилазы в сыворотке крови и моче:у человека альфа-амилаза секретируется поджелудочной и слюнными железами, небольшая ее активность обнаруживается в ткани печени и скелетной мускулатуры. Молекулярная масса фермента относительно низка (»48000), поэтому он фильтруется в клубочках почек и содержится в моче.
У здоровых людей в сыворотке активность фермента от 140 до 350 Е/л, в моче — от 1000 до 2000 Е/л. Активность амилазы увеличивается, главным образом, при заболеваниях поджелудочной железы (при остром панкреатите). К повышению активности альфа-амилазы сыворотки крови приводят заболевания слюнных желез, хронические заболевания почек.
Работа № 5. Влияние адреналина на содержание глюкозы в крови.
Ход работы. У кролика из краевой вены уха или у крысы из хвостовой вены набирают 0,1 мл крови и определяют о-толуидиновым методом содержание глюкозы в крови.
Затем у животного выстригают на боку шерсть, протирают кожу спиртом и водят подкожно 0,1 % раствор адреналина из расчета 0,1 мл на 1 кг веса и через 30 минут повторно определяют содержание глюкозы в крови.
Работа № 6. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови.
Ход работы. У другого кролика из краевой вены уха или у крысы из хвостовой вены взять 0,1 мл крови и определить содержание глюкозы в крови.
У животного выстричь шерсть на боку, обработать спиртом и ввести подкожно инсулин из расчета 1,5 международных единиц на кг веса. Через час повторно определить содержание глюкозы в крови. Ввести животному подкожно 5% раствор глюкозы для предотвращения инсулинового шока: кролику 10 мл, крысе — 1 мл.
Результаты 3-й и 4-й работ внести в таблицу и сделать выводы.
По материалам www.ronl.ru
Лабораторная работа. 1. Определение активности a-амилазы в крови Оборудование: 1. Штатив с пробирками. 2. Мерная коническая пробирка
1. Определение активности a-амилазы в крови
Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении уменьшения концентрации крахмала в пробах после ферментативного гидролиза по сравнению с исходным уровнем, что служит мерой активности амилазы.
Ход работы. В 2 пробирки (опытная и контрольная пробы) наливают по 0,5 мл крахмального субстрата. Опытную пробу прогревают при 37 О С 5 мин, после чего добавляют в нее 0,01мл сыворотки и инкубируют 8 мин при 37 О С в термостате. Сразу же после инкубации опытной пробы в обе пробирки добавляют по 0,5 мл раствора йода и доводят объем проб до 5 мл дистиллированной водой. Сразу же колориметрируют их при красном светофильтре в кюветах толщиной 1 см против воды.
Активность a-амилазы рассчитывают по формуле:
(ЕК – ЕОП)/ЕК х 150 = г крахмала, гидролизованного 1л сыворотки за 1 час инкубации (г/л), где
ЕК – оптическая плотность контрольной пробы,
ЕОП – оптическая плотность опытной пробы,
150 – коэффициент пересчета на количество крахмала в г, гидролизованного 1 л сыворотки за 1 час инкубации.
Норма активности амилазы в сыворотке – 16-30 г/л в час
2.Определение активности a- амилазы в моче
Работу проводят так же, как с сывороткой крови, только в опытную пробу вместо сыворотки добавляют 0,01 мл мочи, разведенной в 100 раз. При расчете активности фермента в формулу добавляют коэффициент, учитывающий разведение мочи.
Норма активности амилазы в моче – 28-160 г/л в час
3. Определение активности a-амилазы в слюне
Работа проводится так же, как с сывороткой и мочой. В опытную пробу добавляют 0,01 мл разведенной в 10 раз слюны. При расчете учитывают коэффициент разведения.
Норма активности амилазы в слюне – 320-640 г/л в час.
Диагностическое значение определения амилазы
Гиперамилаземия. При остром панкреатите активность амилазы крови возрастает в первые 12 – 24 часа в 10-40 раз, затем быстро снижается и приходит к норме на 2-6 сутки.
При остром аппендиците, перитоните, перфоративной язве желудка и двенадцатиперстной кишки активность амилазы повышается в 3-5 раз.
Гиперамилаземия наблюдается также при паротите.
Гиперамилаземию вызывают: адреналин, гистамин, секретин, фуросемид, салицилаты, антикоагулянты, морфин, пантопон, опий, кодеин, тетрациклин, алкоголь.
Гипоамилаземия. Чаще всего снижение активности амилазы свидетельствует о недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы. Также встречается у больных гепатитами, циррозами, злокачественными опухолями с метастазами в печень, обширными ожогами кожи, сахарным диабетом, гипотиреозом, при интоксикациях.
Гиперамилазурия. При остром панкреатите в суточной моче активность амилазы возрастает в 10-40 раз. При этом активность амилазы остается высокой до 7 суток.
Отношение активности амилазы в крови к активности амилазы в моче служит показателем функциональной полноценности почечного фильтра.
Проверка качества усвоения знаний (конечный уровень)
А) Вопросы для защиты лабораторной работы
1. К какому классу ферментов относится амилаза?
2. Назовите субстраты для амилазы.
3. Где образуется амилаза и где действует?
4. Назовите продукты амилазной реакции.
5. Какой принцип лежит в основе метода определения активности амилазы?
6. С какой целью пробы помещают в термостат?
7. Для диагностики каких заболеваний используется определение активности амилазы в крови? моче? слюне?
8. Каковы причины снижения активности амилазы в крови?
9. Каковы причины увеличения активности амилазы в крови?
10. Каковы причины повышения активности амилазы в моче?
11. Чему равна норма активности амилазы в крови? В слюне? В моче?
б) Ситуационные задачи (УИРС)
1. Животному внутривенно ввели стерильный раствор сахарозы. Появится ли сахароза в моче?
2. Употребление в пищу кондитерских изделий, конфет вызывает у ребенка рвоту, понос. Он плохо переносит и сладкий чай, тогда как молоко не вызывает отрицательных реакций. Какой молекулярный дефект является причиной данных нарушений?
3. Больной страдает от судорог в мышцах при напряженной физической работе, но в остальном чувствует себя здоровым. Биопсия мышечной ткани выявила, что концентрация гликогена в мышцах этого больного гораздо выше нормы. Почему накапливается гликоген? Ваши рекомендации такому человеку.
4. Клинические симптомы двух форм галактоземии, одна из которых обусловлена недостаточностью галактокиназы, а другая — галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы, резко различаются по своей тяжести. И в том, и в другом случае молоко вызывает у больных кишечные расстройства, но при недостаточности галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы нарушаются функции печени, почек, селезенки и мозга, а затем наступает смерть. Какие продукты накапливаются в крови и тканях при недостаточности каждого из двух ферментов? Оцените сравнительную токсичность этих продуктов на основе приведенных выше данных.
5. Сделайте предположение о возможных причинах заболевания, если известно, что у больного, длительно страдающего хроническим заболева-нием кишечника – энтероколитом, после молочной пищи стали появляться метеоризм, диарея, колики.
6. Введение животным адреналина вызывает гипергликемию. Почему это не наблюдается у животных с удаленной печенью?
7. Какие реакции характерны для мобилизации гликогена в печени и мышцах?
1) гликоген → глюкозо-1-фосфат→ глюкозо-6-фосфат→ глюкоза
2) гликоген→ глюкозо-1-фосфат→ глюкозо-6-фосфат
По материалам mydocx.ru