Принцип. Белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью; при этом образуются соединения, окрашенные в фиолетовый цвет.
Реактивы. 1. 0,9%-ный раствор натрия хлорида.
2. 0,2 н. (0,2 моль/л) раствор едкого натра, свободный от углекислого газа. 8 т вещества вносят в мерную колбу на 1 л и приливают до метки кипяченой дистиллированной водой или готовят из 1 н. (моль/л) раствора едкого натра: 20 мл 1 н. раствора NаОН доводят до 100 мл кипяченой дистиллированной водой.
3. Биуретовый реактив основной. 4,5 г сегнетовой соли (КNаС4Н4О6) растворяют в мерной колбе на 100 мл в 40 мл 0,2 н. раствора едкого натра. После рас- творения прибавляют 1,5 г меди сульфата (СuSО4*5Н2О) и 0,5 т калия йодида (KI). Перемешивают до полного растворения и доводят до 100 мл 0,2 н. раствором едкого натра. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стоек. 4. 0,5%-ный раствор калия йодида в 0,2 н. растворе едкого натра. 2,5 г калия йодида вносят в мерную колбу на 500 мл и доливают до метки 0,2 н. раствором едкого натра. Хранят в посуде из темного стекла не более 2 нед.
5. Рабочий раствор биуретового реактива. Смешивают одну часть основного биуретового раствора (3) с четырьмя частями 0,5%-ного раствора калия йодида (4) . Хранят в холодильнике в темной посуде не более 2 нед.
6. Стандартный раствор альбумина, основной. В пробирку вносят 1 г кристаллического сывороточного (из человеческой или бычьей сыворотки) альбумина и 9 мл 0,9%-ного раствора хлорпстого натрия. Тщательно перемешивают. 1 мл раствора содержит 0,1 г белка. Хранят в холодильнике. Сывороточный альбумин должен отвечать требованиям стандарта.
Оборудование. Фотоэлектроколориметр; колбы мерные.
Ход определения. К 0,1 мл сыворотки крови прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива, смешивают, избегая образования лены. Через 30 мин (но не позже чем 1 ч) измеряют оптическую плотность на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 540—560 нм (зеленый светофильтр) против контроля (5 мл рабочего раствора биуретового реактива и 0,1 мл 0,9 % -ного раствора натрия хлорида).
Расчет ведут по калибровочному графику, для построения которого готовят рабочие стандартные растворы из основного стандартного раствора 10%-ного белка (табл. 5).
5. Приготовление рабочих стандартных растворов белка
Из каждого (из 4) разведенья в 5 пробирок вносят по 0,01 мл раствора альбумина и обрабатывают, как и сыворотку крови.
Измерения оптической плотности стандартных растворов начинают с раствора наименьшей концентрации. По полученным средним данным из 5 определений строят калибровочную кривую. Калибровочную кривую проверяют периодически.
П р и м е ч а н и я. 1. Содержание белка в стандартном растворе должно быть не менее 7%. 2. При содержании белка в сыворотке больше 10% последнюю разводят физиологвческим раствором 1:1, результат ум- ножают на два. Ошибка метода 2%.
Источник: Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии: Справочное издание/И.П. Кондрахин, Н.В. Курилов, А.Г. Малахов и дрр. –М: Агропромиздат, 1985.-287с.
Быстрый поиск по сайту
Поделитесь в социальных сетях
Читайте нас в:
Нашли ошибку? Выделите ее мышкой и нажмите одновременно Ctrl+Enter Система Orphus
По материалам vet174.ru
Все известные способы определения концентрации общего белка подразделяют на следующие группы:
1. Азотометрические , основывающиеся на установлении количества белкового азота, для нахождения концентрации белка исходят из того, что содержание азота в белках составляет 16%, поэтому используется коэффициент 6,25. Способ неточен, так как содержание азота в различных белковых молекулах колеблется от 14 до 19%.
2. Способы, состоящие в определении плотности сыворотки — способ плавающей капли, также является неточным из-за влияния на плотность других веществ, находящихся в сыворотке.
3. Весовые ( гравиметрические ) — весьма трудоемки и требуют больших количеств сыворотки.
4. Рефрактометрические методы — просты в исполнении, но неточны, так как рефракция сыворотки обусловливается также минеральными веществами и углеводами.
5. Колориметрические , основанные на цветных реакциях белков:
- методы, основанные на неспецифическом связывании красителя ( простой абсорбции ), достаточно чувствительны, но степень связывания красителя зависит от индивидуальных свойств белка (метод с кумасси бриллиантовым голубым).
- биуретовый метод — наиболее широко применяется в настоящее время, основан на специфической реакции пептидной связи с ионами меди в щелочной среде с образованием продукта фиолетового цвета. Существуют разные модификации этого метода с целью увеличения интенсивности окраски и ее стабильности, повышения устойчивости реактива. Например, тартрат добавляют как стабилизатор, который при комплексировании с ионами меди предотвращает их осаждение в щелочной среде, KJ предотвращает спонтанное восстановление щелочного тартрата меди и осаждение оксида меди и, следовательно, повышает устойчивость реактива. Чувствительность и специфичность метода зависит от используемой длины волны: 540-580 нм, 263 нм или 310 нм. Метод считается самым специфичным и точным, так как присутствие ароматических аминокислот, фенолов, мочевой кислоты не влияет на биуретовую реакцию.
- метод Лоури — основан на образовании вольфрамового синего и молибденового синего из фосфорномолибденовой и фосфорновольфрамовой солей реактива Фолина-Чикольте при взаимодействии их с ароматическими аминокислотами, в основном остатками тирозина, но определенный вклад дают триптофан, гистидин, цистеин. Максимум поглощения находится в диапазоне 745-750 нм. В составе рабочего реактива имеется биуретовый реактив, что позволяет определять также пептидные связи. К недостатку метода относится: во-первых, отрицательное влияние на развитие окраски веществ, используемых для выделения, очистки и солюбилизации белков (детергентов, компонентов буферных систем, сульфгидрильных и других восстанавливающих агентов, пуринов, глицина, сахарозы, сернокислого аммония и др); во-вторых, отсутствие линейной зависимости интенсивности окраски от количества белка-стандарта. Метод более чувствителен по сравнению с биуретовым, но специфичность его ниже, так как интенсивность окраски зависит от аминокислотного состава белка, а также от последовательности расположения аминокислот и степени экранирования функциональных групп.
6. Нефелометрические методы.
7. Поляриметрические методы.
8. Спектрофотометрические , заключающиеся в измерении степени cветопоглощения в ультрафиолетовой области при двух длинах волн с дальнейшим расчетом по специальным формулам (230 и 260 нм, 280 и 260 нм, 235 и 280 нм, 215 и 225 нм, 280 и 205 нм).
Унифицированными методами определения общего белка являются:
- в сыворотке крови — биуретовый метод;
- в моче — полуколичественный метод Бранденберга-Робертса-Стольникова и нефелометрия (590-650 нм) после реакции с сульфосалициловой кислотой;
- в ликворе — нефелометрия (410-480 нм) после реакции с сульфосалициловой кислотой и сульфатом натрия;
- в жидкости серозных полостей — нефелометрия (590-650 нм) после реакции с сульфосалициловой кислотой.
Белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди, образуя хелатные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна числу пептидных связей.
По материалам biokhimija.ru
Принцип метода: Ионы меди в щелочной среде реагируют с белком с образованием комплекса фиолетового цвета. Оптическая плотность образующегося комплекса прямо пропорциональна содержанию белка в пробе.
Линейность метода: 10 – 150 г/л.
Общий белок в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25°С) в течение 7 дней, при температуре хранения 2-8°С в течение 1 месяца в плотно закупоренном флаконе.
1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25°С;
3) Автоматические пипетки на 20 мкл и 1000 мкл;
5) Физиологический раствор;
6) Реагент (гидроксид натрия – 600 ммоль/л, калий-натрий тартрат – 32 ммоль/л, сульфат меди – 12 ммоль/л, иодид калия – 30 ммоль/л);
7) Калибратор – калибровочный раствор общего белка, 80,0 г/л.
Перемешать тщательно содержимое пробирок и инкубировать при температуре 25°С в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной (Аоп) и калибровочной (Акалиб) проб против холостой пробы при длине волны 540 нм.
Окраска раствора стабильна в течение 30 минут.
Гемолиз и липемия влияют на результат, поэтому для таких проб анализ следует выполнять с бланком по пробе ( 20 мкл сыворотки смешивается с 1 мл физраствора). Измеряется оптическая плотность бланка против физраствора и ее значение вычитается из оптической плотности анализируемой пробы.
Содержание общего белка в сыворотке рассчитывают по стандарту (калибратор) по формуле:
где С – концентрация общего белка в анализируемой пробе, г/л;
Аоп – оптическая плотность опытной пробы;
Акалиб – оптическая плотность калибровочной пробы;
Скалиб – концентрация общего белка в калибраторе.
При содержании общего белка в пробе свыше 150 г/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.
Клинико-диагностическое значение: Изменения содержания общего белка в сыворотке крови происходят по причине:
1) снижения интенсивности биосинтеза белка в тканях;
2) усиленного распада тканевых белков;
3) нарушения водного баланса;
4) потери белка почками, с кровью.
Гипопротеинемия наблюдается при нефротическом синдроме, синдроме мальабсорбции, заболеваниях кожи (ожог, экзема), массивных кровотечениях, задержке солей и воды (заболевания почек), неправильном питании и голодании. Нарушением синтеза белка, приводящему к снижению его концентрации в сыворотке крови, сопровождаются раковая кахексия, длительные воспалительные процессы.
Гиперпротеинемия наблюдается при состояниях и болезнях, сопровождающихся дегидратацией организма (тяжелые травмы, понос, рвота, сахарный диабет). Она характерна также для хронических воспалительных заболеваний (ревматоидный артрит, диффузные болезни соединительной ткани – коллагенозы, цирроз печени) и острых воспалительных процессов в стадии острой фазы, наблюдается также при макроглобулинемии Вальденстрема.
По материалам biohimist.ru
Определение общего белка по биуретовой реакции является на сегодняшний день самым распространенным методом определения общего белка в сыворотке крови. Метод относительно дешев, прост, обладает хорошей воспроизводимостью и специфичностью, использование его позволяет выполнять исследование как на анализаторах (автоматических и полуавтоматических), так и на обычном фотометре.
Белки реагируют в щелочной среде с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в фиолетовый цвет. По интенсивности окрашивания, которое пропорционально количеству белка, определяют содержание его в сыворотке крови.
Для определения общего белка крови по биуретовой реакции кровь желательно брать утром натощак.
- Натрия хлорид, ч. д. а. или х. ч., 154 ммоль/л (изотонический раствор): 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят до метки водой.
- Натр едкий, ч. д. а. или х. ч., 0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.
- Калия йодид, ч. д. а. или х. ч., 30 ммоль/л раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра: 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором едкого натра до метки и растворяют. Реактив стабилен в течение 2 недель при хранении в посуде из темного стекла.
- Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль) ч. д. а.
- Меди сульфат 5-водный ч. д. а. или х. ч.
- Биуретовый реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла не более месяца.
- Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5% раствора йодида калия. Реактив хранят в темном месте не более 2 недель.
- Калибровочный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки) — 100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия: 1 г альбумина из человеческой или бычьей сыворотки растворяют в 6 — 7 мл 0,9% раствора хлорида натрия и доводят изотоническим раствором хлорида натрия до объема 10 мл; 1 мл стандартного раствора содержит 0,1 г белка.
Для анализа могут использоваться как сыворотка, так и плазма. При этом обычно получают сравнимые результаты, хотя, из-за присутствия фибриногена, уровень общего белка в плазме на 2–4 г/л выше, чем в сыворотке.
Определение содержания белка в сыворотке, полученной в вакуумных системах с разделяющим гелем и без него, дает сопоставимые результаты. Не было получено существенных различий в содержании белка в образцах крови, собранных в стеклянных или пластмассовых вакуумных системах.
Для исследования не следует использовать гемолизированную сыворотку, так как гемоглобин также является белком и будет вступать в биуретовую реакцию, что приведет к ложному завышению результатов анализа: присутствие гемоглобина приводит к завышению результатов на 3 % на каждый 1 г/л свободного гемоглобина в сыворотке.
Нежелательно использовать хилезную сыворотку, так как она из-за мутности будет оптически интерферировать с результатами определения, а следовательно приведет к ложному завышению результатов. Для устранения интерференции, вызванной значительной липемией применяют экстракцию диэтиловым эфиром. При незначительном присутствии липидов можно провести исследование, установив «бланк» по пробе больного, либо развести пробу изотоническим раствором хлорида натрия, а затем умножить результат на степень разведения.
Интерферирующее действие оказывает и билирубин при концентрации более 85 мкмоль/л. Поэтому в случае гипербилирубинемии также используют либо разведение сыворотки, либо установку «бланка» по пробе больного.
В ряде случаев в реакцию могут вмешиваться препараты, применяющиеся для лечения, особенно у тяжелых больных. Так, например, декстраны, используемые в качестве плазмозамещающих растворов, образуют комплекс с медью и тартратом в реакционной смеси и приводят к образованию рыхлого синего осадка. Степень вмешательства зависит от концентрации декстрана и состава биуретового реактива. При вводимых обычно количествах декстрана величина ошибки может составлять от 3 до 50 %. Полагают, что добавление глицерина в реактив или использование низкой концентрации NaOH способны предотвратить вмешательства декстрана в ход реакции. Присутствие в образце ионов аммония может способствовать образованию комплексов аммония с ионами меди, приводить к снижению концентрации ионов меди в реакционной среде, и, соответственно, к снижению скорости реакции и ложноотрицательным результатам. В редких случаях вмешательство лекарственных препаратов, находящихся в сыворотке таково, что при взаимодействии биуретового реактива с сывороткой наблюдается либо развитие окраски, отличной от фиолетовой, либо появление мутности. Оценить количество белка в такой сыворотке невозможно.
Содержание общего белка устойчиво в сыворотке и плазме в течение 1 недели при комнатной температуре и, по крайней мере, 2 месяца при -20 °C.
Опытная проба: к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 минут (и не позднее чем через час) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500 — 560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.
Холостая проба: к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее обрабатывают как опытную пробу.
По материалам www.clinlab.info