Электрофорез белков сыворотки крови на пленках из ацетата целлюлозы

Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами. Направление движения белков в электрическом поле зависит от рН среды. Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока к аноду – в щелочной среде, к катоду – в кислой среде.

Разделение белков сыворотки обычно проводят в буферном растворе при рН 8,6 – 8,9. В качестве носителя используют пленки из ацетата целлюлозы. В этих условиях заряженные белки сыворотки крови перемещаются по смоченным пленкам из ацетата целлюлозы в направлении анода со скоростью, зависящей от величины заряда и относительной молекулярной массы белка. Этот след представляет собой дорожку, на которой после окрашивания ясно видны места концентрации белков различных фракций. Наиболее быстро движутся альбумины, затем a1-, a2-, b-глобулины, и, наконец, g-глобулины. По этим следам (дорожкам) можно определить содержание белка в различных белковых фракциях пробы. Методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы можно получить 5 и более белковых фракций.

Нормальные величины белковых фракций зависят от вида применяемого красителя:

1) Аппарат для электрофореза;

2) Источник постоянного тока;

4) Веронал-мединаловый буфер, рН 8,6;

5) Раствор амидо черного для окрашивания электрофореграммы (амидо черный 250 мг в 100 мл 7% уксусной кислоты);

6) Раствор для отмывания (5-7% уксусная кислота)

7) Раствор для просветления пластинок из ацетата целлюлозы (смесь этанола, уксусной кислоты и глицерина);

Просветления пластинок из ацетата целлюлозы можно достигнуть также, погрузив пластинки на 2-3 минуты в глицерин или вазелиновое масло.

1. Сухие пластинки из ацетата целлюлозы помечают карандашом, а затем осторожно кладут на поверхность буфера для электрофореза так, чтобы они поглощали жидкость только снизу с помощью капиллярных сил. При быстром погружении пластинки в буфер в порах ацетата целлюлозы может остаться воздух.

2. Извлекают пластинки из буферного раствора и аккуратно зажимают их между листами плотной фильтровальной бумаги, не допуская высыхания пластинок. О высыхании свидетельствует появление белых пятен на поверхности пластинки. В этом случае пропитывание буфером следует повторить (см. пункт 1).

3. Влажную пластинку закладывают в рамку и помещают в электрофоретическую камеру.

4. С помощью апликатора на поверхность пластинки с катодного краю наносят образец – 0,2-0,4 мл сыворотки крови.

5. Сразу после нанесения образцов включают электрический ток.

Для кратковременного электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы лучшие результаты получаются при стабильном напряжении. Как правило, для пластинок толщиной около 120 мкм сила тока не должна превышать 0,5 мА на 1 см ширины пластинки. Для более толстых пластинок (250-300 мкм) сила тока может достигать 1мА на 1 см ширины пластинки. Применив высокий градиент напряжения (30-40 В на 1 см) можно получить четкое разделение фракций белка за короткий промежуток времени (20-30 минут).

6. После отключения тока пластинки осторожно переносят в красящий раствор на 5 минут.

7. Затем пластинки отмывают до отбеливания фона в 5-7% растворе уксусной кислоты дважды по 3 минуты. Промывают 3 раза дистиллированной водой. Просушивают между листами фильтровальной бумаги.

8. Проводят просветление пластинок. Для этого помещают пластинки на 30 секунд в 90° этиловый спирт. Затем помещают их в осветляющий раствор на 30 секунд. Наклеивают на стекло и помещают в сухожаровой шкаф на 5 минут при температуре 100°С.

9. Высушенную пластинку сканируют на денситометре придлине волны 600 нм, характерной для красителя амидо черного.

Данные о содержании белка в белковых фракциях сыворотки крови могут быть представлены как в форме процентного распределения белка по фракциям, так и в форме содержания белка в отдельных фракциях в г/л (для этого предварительно в крови определяют содержание общего белка биуретовым методом).Результаты измерения заносят в таблицу:

По материалам biohimist.ru

УСТРОЙСТВО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ НА ПЛЕНКАХ ИЗ АЦЕТАТА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ

С РЕГУЛИРУЕМЫМИ ПАРАМЕТРАМИ НАПРЯЖЕНИЯ,

СИЛЫ ТОКА И РЕЖИМОВ УЭФ-01-«АСТРА»

Руководство по эксплуатации

9. Характерные неисправности и методы их устранения . . . . . . . . . . . . . . .

11. Упаковка, хранение, транспортировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Устройство электрофореза сыворотки крови на пленках из ацетата целлюлозы с регулируемыми параметрами напряжения, силы тока и режимов УЭФ-01-«АСТРА» (в дальнейшем – устройство) предназначено для исследования спектра сыворотки крови методом электрофореза в биохимических, клинико-диагностических и научных лабораториях медицинских учреждений.

Устройство поставляется в следующем комплекте

Мостик для пленки формата 57×140 мм

Сетевой шнур источника питания

К работе с устройством допускается медперсонал, ознакомившийся с настоящим руководством и прошедший специальное обучение.

1. 99 mA (дискретность 1 mA)

1…99 мин (дискретность 1 мин.)

от короткого замыкания (ограничение по току и отключение), от обрыва цепи (отключение)

четырехразрядный индикатор (три разряда – цифровая информация, один разряд – регулируемый параметр), наличие светодиодов «Режим», пьезоэлектрический звукоизлучатель

текущие параметры, обрыв цепи, короткое замыкание

Материал и тип электродов

химически стойкий пластик

мембраны из ацетата целлюлозы

Количество аппликаторов в комплекте

Принцип электрофоретического разделения веществ заключается в использовании свойства их перемещения в постоянном электрическом поле определенной напряженности. Скорость перемещения веществ в этом случае зависит от электрического заряда их молекул, от молекулярной массы и других факторов. Наиболее удобным для использования в клинической практике является зональный электрофорез на поддерживающих средах-носителях, в качестве которых используется хроматографическая бумага, ацетатцеллюлозные мембраны, агаровый, крахмальный или полиакриламидный гели и др., а также комбинированные среды.

Электрофорез на бумаге все ещё применяется в некоторых лабораториях, однако, этот способ имеет существенные недостатки: низкое качество разделение на фракции из-за неоднородности бумаги, длительность процессов разделения, окрашивания, отмывания и т. д. Электрофорез в агаровом, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле дает существенно лучшие результаты, позволяя получать четкое разделение и идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30), но ему присущи свои недостатки — сложность процедуры приготовления геля и дороговизна готовых гелевых пластин. Использование для электрофореза мембран из ацетата целлюлозы позволяет достигнуть компромисса и использовать главные особенности пленок – химическую однородность материала и одинаковый размер пор, очень малую емкость слоя, требующую малый объём пробы (0,2–2 мкл), быстроту разделения и окраски белков (20–80 мин), незначительный эндоосмос, легкость отмывания фона, а также относительно низкую их стоимость.

Знак и величина заряда молекул, а значит, направление и скорость их движения при электрофоретическом разделении зависят от значения рН и ионной силы среды. В связи с этим для получения сопоставимых данных электрофорез должен осуществляться при строго определенном значении указанных параметров, т. е. в стандартном буферном растворе. В качестве электролита для электрофореза белков сыворотки крови чаще всего применяются веронал-мединаловый, веронал-ацетатный, мединал-цитратный с рН=8,6 или трис-буфер с рН=8,9; для электрофореза липопротеидов – веронал-мединаловый с рН=8.6. 8.8 или трис-глициновый буфер.

Устройство электрофореза УЭФ-01-«АСТРА» обеспечивает проведение всех указанных этапов электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках.

Освободите от упаковки источник питания и камеру деления. Установите их на ровный стол. Вставьте сетевой шнур источника питания в гнездо «СЕТЬ», расположенное на задней панели источника питания, а шнур «ВЫХОД» – в гнездо на задней стенке камеры деления. Включите прибор в розетку. Включите переключатель «СЕТЬ» находящийся на задней панели. После окончания звукового сигнала и прохождения теста индикации устройство готово к работе.

При отсутствии в лаборатории розетки с заземлением ее следует предварительно установить. Использование заземления обязательно!

4. ПОДГОТОВКА ПРИБОРА К РАБОТЕ

Приготовить электродный буфер и красящий раствор в соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору реактивов.

Сетевую вилку прибора подключить к сетевой розетке, которая для обеспечения безопасности должна иметь заземляющий контакт.

Подключить к выходному кабелю прибора камеру деления. Налить буфер в камеру так, чтобы его уровень не доходил на 2–3 мм до края барьера, разделяющего два отделения камеры.

Включить выключатель СЕТЬ на задней панели прибора. Запустится тест индикатора (последовательно высветятся цифры от 0 до 9). После окончания теста прозвучит звуковой сигнал, на индикаторе прибора появится надпись Р1 (режим 1).

Если Вы хотите ввести новые параметры – воспользуйтесь пунктом 7 данного Руководства.

Налить в емкости для реагентов по 100 мл буферного раствора, красителя и отмывающего раствора. Извлеченную из пачки ацетатцеллюлозную пленку аккуратно поместить на поверхность электродного буфера на 10–25 минут, следя за равномерностью смачивания. Слишком быстрое погружение в раствор может привести к задержке пузырьков воздуха в порах. Удалить избыток раствора с поверхности, слегка отжав пленку между листами фильтровальной бумаги. Закрепить пленку в мостике с желтым замком. Маркировать пленку, произведя прокол о шип в основании мостика.

По материалам gigabaza.ru

В плазме человеческой крови находится множество белковых компонентов. Они различны по своему составу, строению и подвижности в определенной среде, проводящей электрический ток. На этом и строится разделение общего белка, который локализуется в плазме, на различные белковые фракции. При проведении электрофореза сыворотки крови выясняют количественное отношение отдельных белковых составляющих и структур. Это необходимо для определения наличия у человека различных патологических явлений, например инфекций или онкологии. Именно электрофорез белков сыворотки крови имеет большое значение при проведении диагностики различных болезней.

Для расщепления белковых фракций применяют электрофорез сыворотки крови, принцип которого основан на разной подвижности белковых компонентов в созданном электрическом поле. Такой метод исследования является более точным и информативным, в отличие от стандартного общего анализа крови. Но при этом электрофорез показывает только количество определённой фракции белка, характер и степень патологического процесса в общей форме. Анализ проведенных исследований позволяет медицинским специалистам выяснить, какое именно соотношение белковых фракций наблюдается в организме человека, и определить специфику патологии, присущую конкретному заболеванию.

Большую часть основной биологической жидкости человека, или крови, составляют белки. В общем количестве их норма находится в пределах 60-80 г/л. Для получения точного анализа проводится электрофорез сыворотки крови на бумаге. Это исследование является самым распространенным способом анализа. Основной средой является особая фильтровальная бумага. Главная ее особенность – высокая гигроскопичность. Такая бумага может поглотить воды больше своего веса в 130-200 раз. В зависимости от применяемого оборудования электрофорез на бумаге длится 4-16 часов. Происходит подразделение белковых структур. Затем полосы бумаги обрабатывают специальными красками для получения анализа. Такая методика является самой распространенной в работе медицинских лабораторий. За счёт воздействия электрического тока белковые фракции, заряженные отрицательно, двигаются в сторону положительно заряженного электрода. Благодаря этому белковые составляющие крови подразделяются на 5 известных фракций:

Альбумины заряжены отрицательно, имеют маленькую, по сравнению с другими фракциями, молекулярную массу. За счет этого скорость их передвижения гораздо выше, чем у остальных фракций, и они дальше всех локализуются от участка старта. Первые три фракции глобулина передвигаются с более низкой скоростью из-за своей массы. Но самая маленькая скорость регистрируется у γ-глобулинов. Эти белки имеют большую массу и крупные, относительно других, размеры. Их заряд почти нейтрален, поэтому данная белковая фракция практически не сдвигается с линии старта.

В настоящее время электрофорез сыворотки крови часто проводимый анализ для постановки точного диагноза болезни. Этот анализ могут назначить как терапевты, так врачи узкого профиля. Показаниями по проведению исследований будут:

различные воспаления;
болезни хронической природы;
патологические процессы в соединительной ткани;
внутреннее кровотечение;
злокачественные новообразования.

Для того чтобы полученные результаты поведенных исследований были верными, не менее чем за 8 часов до сдачи крови необходимо отказаться от приёма еды. Кроме того, необходимо согласовать прием лекарственных средств, если таковые имеются, с лечащим врачом.

Для того чтобы результаты не были по ошибке завышены, необходимо снизить до минимума возможность свертывания крови для определения показателя белковых фракций и общего белка. Электрофорез сыворотки крови проводится аккуратно, поскольку существует вероятность искажения полученных результатов из-за фибриногена. Он может прятать ненормальные белки или быть спутанным с ними.

В течение суток после сдачи пробы будет готов анализ на электрофорез белков сыворотки крови. Норма полученных показателей по категориям у взрослых людей:

Общий белок – 63-82 г/л.
Альбумины – 40-60 % от общего количества фракций.
α₁-глобулины – 2-5 %.
α₂-глобулины – 7-13 %.
β-глобулины – 8-15 %
γ-глобулины – 12-22 %.

Изменение количества любой белковой фракции в большую или меньшую сторону может свидетельствовать о развитии той или иной патологии. Для получения достоверной информации об этом необходим электрофорез белков сыворотки крови. Расшифровка результатов облегчит медицинским специалистам постановку диагноза и выбор лечения.

В самом начале при анализе полученных результатов определяют количество альбумина. Увеличение этой фракции может говорить об обезвоживании. Такое может произойти, если у больного отмечается затяжная рвота или нарушения в пищеварительной системе. Также увеличение альбумина происходит при ожогах большой площади кожного покрова.

Гораздо опаснее, если в организме снижается количество альбуминов, это может говорить о следующих патологиях:

Поражения почек и печени.
Патологии желудочно-кишечного тракта.
Инфекционные процессы.
Нарушения в деятельности сердечно-сосудистой системы.
Кровотечения.
Злокачественные новообразования.
Сепсис.
Ревматизм.

Незначительное уменьшение количества альбуминов может быть также:

У будущих матерей.
При превышении дозы лекарственных препаратов.
При длительной лихорадке.
У заядлых курильщиков.

Уменьшение количества a1-глобулинов регистрируется при недостатке α₁-антитрипсина. Увеличение же отмечают при обострении воспалений в организме, нарушениях в работе печени, при тканевом распаде.

Регистрируют его при сахарном диабете, воспалительных процессах в поджелудочной железе, у новорожденных детей при желтухе, при гепатитах токсического происхождения. Свидетельствует оно и о неправильном, несбалансированном питании.

Происходит при наличии следующих заболеваний:

Воспаления, особенно с присутствием гнойного экссудата (воспаление легких и другие процессы с наличием гноя).
Поражения соединительной ткани (например, ревматизм).
Злокачественные новообразования.
Периоды восстановления после ожогов.
Поражение почек.

Кроме того, такое явление характерно для гемолиза крови в пробирке во время проведения исследования.

Проявляется при гиперлипопротеидемии (увеличении количества липидов в крови), патологиях печени и почек. Можно обнаружить при открытой язве желудка, а также гипотиреозе (нарушение работы щитовидной железы). Снижение фракции регистрируют при гипобеталипопротеинемии (повышение в крови компонента беталипопротеин).

Эта фракция включает в свой состав иммуноглобулины. Поэтому увеличение γ-глобулинов регистрируется при сбоях в иммунитете. Обычно это происходит при различных инфекциях, развитии воспалительного процесса, изменениях ткани и ожоговых поражениях. Рост γ-глобулинов отмечают у больных хронической формой гепатита. Практически такая же картина характерна для цирроза печени. При запущенных случаях данного заболевания количество белковой фракции γ-глобулинов значительно выше показателя альбуминов. При определенных болезнях могут возникать сбои в образовании γ-глобулинов, и происходит развитие измененных протеинов в крови – парапротеинов. Для выяснения характера такого развития производится дополнительное исследование – иммуноэлектрофорез. Такая картина характерна для миеломного заболевания и патологии Вальденстрема.

Увеличение количества γ-глобулинов также присуще следующим патологиям:

красной волчанке;
эндотелиоме;
ревматоидной форме артрита;
остеосаркоме;
хронической форме лимфолейкоза;
кандидомикозу.

Снижение показателя γ-глобулинов подразделяют на 3 вида:

Физиологический (характерен для детей в возрасте от трех до пяти месяцев).
Врожденный (развивается с момента рождения).
Идиопатический (когда причину развития установить не удается).

Вторичное снижение регистрируется при развитии заболеваний, которые вызывают истощение иммунной системы. В последнее время в медицинской практике все чаще проводится анализ на определение количества преальбуминов. Обычно такое исследование проводят больным, находящимся в реанимации.

Уменьшение количества преальбуминов очень важный и точный тест на определение недостаточности белковых структур в организме пациента. При проведении анализа на преальбумины выполняют коррекцию белкового метаболизма у таких пациентов.

Принцип проведения подобного анализа схож с технологией выполнения электрофореза сыворотки крови. Проводят его для более точной постановки диагноза или обнаружения других патологий. Кроме того такой анализ поможет выявить у больного наличие протеинурии.

Электрофорез сыворотки крови и мочи – важные методы в диагностике различных инфекционных заболеваний. Благодаря методике исследования и высокой точности они помогают определить вид патологии. Точный диагноз – верный путь к правильному лечению и полному выздоровлению.

По материалам fb.ru

Pharmacopoeia.ru — сайт о регистрации лекарственных средств в России. Site about registration of Drugs in Russia and EAEU (CIS).

ОФС.1.8.2.0009.15 Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы

Содержимое (Table of Contents)

ОФС.1.8.2.0009.15 Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы, который предназначен для определения однородности (идентичности) иммунобиологических лекарственных препаратов (иммуноглобулинов). Метод основан на различной скорости перемещения белков в электрическом поле в зависимости от соотношения основных и кислотных групп белка, рН, ионной силы буферного раствора, величины заряда и молекулярной массы частиц.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение однородности ОФС.1.8.2.0009.15

лекарственных препаратов

из сыворотки крови человека

и животных методом

электрофореза на плёнках

из ацетата целлюлозы Вводится впервые

Белки движутся в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, движутся к аноду (+), а положительно заряженные – к катоду (–). По скорости движения в электрическом поле белки делятся на 5 основных фракций: альбумины, α1-глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины. Наименьшей скоростью продвижения обладают γ – глобулины (молекулярная масса 150-160 тыс. кДа); они практически остаются на линии старта, т.к. их заряд близок к нейтральному. Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и меньшей молекулярной массой (67-70 тыс. кДа), поэтому в электрическом поле они движутся с наибольшей скоростью и в результате обнаруживаются дальше других белковых фракций от линии старта. С меньшей скоростью, чем альбумины, в электрическом поле перемещаются α1-, α2- и β-глобулины.

На увлажнённую плёнку из ацетата целлюлозы размером 90х90 мм, заправленную в специальную рамку, наносят 2-4 мкл исследуемых образцов (5 образцов в 2-х параллельных определениях) и для идентификации контрольный образец – сыворотка для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций. Определение проводят в 2-х параллельных определениях. Предварительно в электродные секции камеры (аппарат для электрофореза на плёнках из ацетата целлюлозы) наливают барбиталовый буферный раствор (рН 8,4). Вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой подходящий коммерческий буферный раствор с указанным значением рН.

Рамку с пленкой из ацетата целлюлозы помещают в разделительную камеру, закрывают крышкой, включают источник питания (сила тока 8-10 мА, напряжение 100-129 В). Разделение проводят в течение 30-40 мин. После проведения электрофореза снимают крышку разделительной камеры, не допуская попадания конденсационной воды на пленку. Рамку с плёнкой извлекают из камеры, избегая контакта с участками, где происходил электрофорез испытуемых образцов. Пленку достают из рамки пинцетом и дают подсохнуть на воздухе. Затем плёнку обрезают с обоих концов (около 2,5 мм), помещают в кювету с 50 мл раствора красителя и выдерживают в течение не более 5 мин (контакт с красителем в течение более длительного времени может деформировать плёнку). Плёнку вынимают из кюветы и после стекания избыточной жидкости помещают на 5 мин поочерёдно в 3 кюветы, со 100 мл отмывочной жидкости (для ускорения процесса отмывки кювету покачивают). После отмывки фон плёнки должен приобрести бледно-голубое окрашивание или стать почти прозрачным. Далее плёнку тщательно промывают водой, помещают между листами фильтровальной бумаги и слегка промокают.

Идентификацию белковых фракций проводят путём сравнения электрофореграммы испытуемых образцов с электрофореграммой контрольной сыворотки для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций. Сыворотка должна разделиться не менее, чем на 5 фракций: альбумин, α1- и α2-глобулины, β-глобулин и γ-глобулин. После проведения электрофореза проводят количественное определение фракций иммуноглобулина путём извлечения краски из плёнки элюирующим раствором с последующим колориметрированием или путём денситометрии электрофореграмм.

Колориметрическое определение. Извлечение краски каждой фракции проводят в 3 мл элюирующего раствора с 2-х параллельных электрофореграмм. Элюцию проводят в течение 40 мин при многократном встряхивании. Оптическую плотность полученного элюата измеряют на спектрофотометре при длине волны 620 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по отношению к элюату неокрашенного участка электрофореграммы. Сумму оптических плотностей всех белковых фракций принимают за 100 % и рассчитывают процентное содержание каждой фракции препарата иммуноглобулина.

Денситометрическое определение. Электрофореграммы исследуемых образцов высушивают между листами фильтровальной бумаги в полиэтиленовом пакете (такие условия высушивания исключают деформацию плёнки). Высушенные плёнки просветляют вазелиновым маслом, пропитывая их таким образом, чтобы в плёнке не остались пузырьки воздуха. Для этого плёнку следует держать горизонтально и нижней поверхностью осторожно касаться масла. Избыток вазелинового масла удаляют, промокая плёнку между листами фильтровальной бумаги.

Фракции иммуноглобулина записываются денситометром в виде пиков. Величина площади каждого пика пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком. С помощью автоматического интегратора площадь каждого пика вычисляют по формуле площади прямоугольника

(h ∙ d, где h – максимальная высота пика, d – ширина пика). Сумма площадей всех пиков фракций иммуноглобулина принимается за 100 % и вычисляется процентное содержание каждой фракции в испытуемом препарате иммуноглобулина.

Подготовка плёнки из ацетата целлюлозы. Плёнку смачивают в барбиталовом буферном растворе и гладкой стороной помещают в кювету на поверхность буферного раствора на 2 мин, а затем пинцетом погружают на дно кюветы и выдерживают 5 мин. После этого плёнку вынимают пинцетом, избыток влаги удаляют между листами фильтровальной бумаги и заправляют в рамку, избегая неравномерного натяжения и провисания.
Подготовка испытуемых образцов. Испытуемые образцы предварительно обрабатывают 0,05% раствором красителя – бромфенолового синего, используемого для отслеживания продвижения и распределения белковых фракций препарата иммуноглобулина в процессе электрофореза. В пробирку типа Эппендорф помещают 100 мкл испытуемого образца и 10 мкл 0,05% раствора бромфенолового синего и перемешивают. Окрашенные испытуемые образцы в объеме 2-4 мкл помещают в каждую лунку лотка.
Приготовление барбиталового буферного раствора (рН 8,4)*. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 8,5 г натрия барбитала, растворяют в 600-700 мл воды очищенной, прибавляют 11 мл 1М раствора хлористоводородной кислоты, доводят объём раствора водой до метки и перемешивают.

*Вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой другой коммерческий буферный раствор с известным значением рН.

4.Приготовление 1 М раствора хлористоводородной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 85 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, доводят объём раствора до метки и перемешивают.

Приготовление красителя. К 0,5 г амидочёрного 10 Б прибавляют 10 мл уксусной кислоты ледяной, 3 г трихлоруксусной кислоты и 90 мл этилового спирта и перемешивают. Для полного растворения краситель оставляют на 24 ч. Перед использованием раствор красителя перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
Приготовление раствора для отмывки электрофореграмм. В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл помещают 40 мл уксусной кислоты ледяной, прибавляют 700 мл воды очищенной и перемешивают. Затем объём раствора доводят водой очищенной до метки и вновь перемешивают.
Приготовление элюирующего раствора. Смешивают 10 мл 1 М раствора натрия гидроксида с 1 мл 1 М раствора натрия эдетата (трилон Б).

Если условия проведения анализа и реагенты отличаются от приведенных в данной статье, они должны быть указаны в соответствующей фармакопейной статье или нормативной документации с изложением иной валидированной методики анализа.

По материалам pharmacopoeia.ru